Entdeckung und optimierte Extraktion des Anti

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 11102 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ulmus Macrocarpa Hance-Rinde (UmHb) wird in Ostasien seit langem als traditionelles pflanzliches Arzneimittel zur Behandlung von Knochenerkrankungen eingesetzt. Um ein geeignetes Lösungsmittel zu finden, verglichen wir in dieser Studie die Wirksamkeit von UmHb-Wasserextrakt und Ethanolextrakt, die die Differenzierung von Osteoklasten hemmen können. Im Vergleich zu zwei Ethanolextrakten (70 % bzw. 100 %) hemmten hydrothermale Extrakte von UmHb die Rezeptoraktivatoren der durch den Kernfaktor κB-Ligand induzierten Osteoklastendifferenzierung in murinen Makrophagen aus dem Knochenmark wirksamer. Mithilfe von LC/MS-, HPLC- und NMR-Techniken haben wir zum ersten Mal festgestellt, dass (2R,3R)-Epicatechin-7-O-β-D-apiofuranosid (E7A) ein spezifischer Wirkstoff in UmHb-Hydrothermalextrakten ist. Darüber hinaus haben wir durch TRAP-Assay, Pit-Assay und PCR-Assay bestätigt, dass E7A eine Schlüsselverbindung bei der Hemmung der Osteoklastendifferenzierung ist. Die optimierten Bedingungen zur Gewinnung von E7A-reichem UmHb-Extrakt waren 100 ml/g, 90 °C, pH 5 und 97 Minuten. Unter diesen Bedingungen betrug der Gehalt an E7A 26,05 ± 0,96 mg/g Extrakt. Basierend auf TRAP-Assay, Pit-Assay, PCR und Western Blot zeigte der optimierte Extrakt aus E7A-reichem UmHb eine stärkere Hemmung der Osteoklastendifferenzierung im Vergleich zum nicht optimierten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass E7A ein guter Kandidat für die Prävention und Behandlung osteoporosebedingter Erkrankungen wäre.

Zwanzig Prozent aller Knochen werden jedes Jahr durch einen kontinuierlichen Ausgleich zwischen Knochenbildung durch Osteoblasten und Knochenresorption durch Osteoklasten ersetzt1. Dieser kontinuierliche Prozess, der als Knochenumbau bezeichnet wird, kann die Form, Qualität und Größe des Skeletts erhalten. Im Gegensatz zum Erscheinungsbild einer porösen mineralisierten Struktur zielt der Knochenumbau darauf ab, den gesunden Zustand des Knochengewebes durch wiederholte Zerstörungs- und Resorptionsvorgänge durch ein kontinuierlich aktives Stoffwechselsystem aufrechtzuerhalten, das auf der Interaktion zwischen Osteoklasten und Osteoblasten basiert. Osteoklasten sind mehrkernige Zellen (MNCs), die aus der Differenzierung von Monozyten-Makrophagen-Linien stammen und Knochen in mehreren Schritten resorbieren. Wenn die Resorption von Osteoklasten schneller voranschreitet als die Knochenproduktion durch Osteoblasten, nehmen die Knochendichte und die Bestandteile des Knochens selbst ab, was zu Knochenerkrankungen führt2.

Die Gattung Ulmus aus der Familie der Ulmaceae bewohnt gemäßigte und tropische Bergregionen der Vereinigten Staaten, Eurasiens und des Nahen Ostens und blüht und verbreitet sich in weiten Teilen der nördlichen Hemisphäre. Mehr als 40 Ulmus-Arten sind weltweit verbreitet. Zu den repräsentativen in Korea heimischen Arten gehören Ulmus pumila L, Ulmus parvifolia Jacq, Ulmus davidiana Planchon und Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai und U. Macrocarpa Hance. Insbesondere Ulmus Macrocarpa Hance Bark (UmHb), auch bekannt als Yubaekpi, Yupi und Yugeunpi, ist die Schale einer Pflanze, die in Ostasien nach dem Trocknen und Mahlen in Form von Tee als Kräutermedizin verzehrt wird. Diese Pflanzen werden auch Nasenbäume genannt, da sie seit der Antike, als sie als Tee verzehrt wurden, dafür bekannt sind, Rhinitis zu lindern3.

Kürzlich wurden Rohextrakte von U. Macrocarpa Hance auf die Modulation von Hyperlipidämie4, die Behandlung von Colitis ulcerosa5, antikokzidiale Wirkung6, blutdrucksenkende Eigenschaften7 und abgeschwächte H2O2- und UVB-induzierte Hautalterung8 untersucht. Die Forschung zur Behandlung von Knochenerkrankungen mit Bäumen der anderen Gattung Ulmus konzentrierte sich im Allgemeinen auf die Förderung des Wachstums und der Proliferation von Osteoblasten oder die Hemmung der Differenzierung von Osteoklasten. Frühere Studien an einer anderen Gattung zeigten, dass Extrakte aus U. davidiana Planch die Differenzierung von Osteoblasten förderten9, während aus der Rinde von Ulmus wallichiana isolierte Flavonoide die Osteoblastenfunktion stimulierten und die Differenzierung von Osteoklasten und Adipozyten hemmten10. Es wurde berichtet, dass Quercetin-6-C-β-D-glucopyranosid aus U. wallichiana Planchon die Osteoklastenbildung wirksam hemmt und den durch Ovarektomie verursachten Knochenverlust bei Mäusen verbessert11.

In einer früheren Studie fand unsere Gruppe im Ethanolextrakt von UmHb aktive Verbindungen, die die Differenzierung von Osteoklasten hemmen12. Da Asiaten Yubaekpi als heißen Tee oder als Kräutermedizin trinken, haben wir in der aktuellen Studie die Fähigkeit des Heißwasserextrakts von UmHb untersucht, die Differenzierung von Osteoklasten zu hemmen. Eine Verbindung, die in früheren Studien nicht in Ethanolextrakten gefunden wurde, wurde durch Techniken der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), der Massenspektrometrie (MS) und der Kernspinresonanz (NMR) gereinigt und identifiziert. In dieser Studie wurde zum ersten Mal der Wirkstoff des Heißwasserextrakts von UmHb isoliert und als (2R,3R)-Epicatechin-7-O-β-D-apiofuranosid (E7A) identifiziert. Unseres Wissens ist dies auch der erste Bericht, dass E7A, das mit heißem Wasser aus UmHb extrahiert wurde, die Differenzierung von Osteoklasten hemmt. Darüber hinaus haben wir die Ulmus-Arten aus der Rinde ausgewählt, bei denen am meisten E7A extrahiert werden konnte. Darüber hinaus wurde die Extraktionsmethode durch die Response Surface Methodology (RSM) optimiert, um möglichst viel E7A zu erhalten. Schließlich zeigten wir, dass der optimierte UmHb-Extrakt die Osteoklastendifferenzierung dosisabhängig hemmte.

In dieser Studie verglichen wir zunächst die Fähigkeit des Heißwasserextrakts, die Osteoklastendifferenzierung zu hemmen, mit der eines 70 % (oder 100 %) Ethanolextrakts. 300 mg getrocknetes Rohmaterial (UmHb) wurden zu 30 ml destilliertem Wasser, 70 % Ethanol oder 100 % Ethanol bei 70 °C gegeben, gefolgt von einer 120-minütigen Extraktion. Wie in Abb. 1A gezeigt, hemmten die Heißwasserextrakte die RANKL-induzierte Osteoklastendifferenzierung effizienter als die Ethanolextrakte. Der 100 %ige Wasserextrakt reduzierte die Anzahl der TRAP-positiven BMCs/Well um 26,72 % im Vergleich zum Vehikel, selbst bei einer Konzentration von nur 3 µg/ml. Unter den experimentellen Bedingungen der vorherigen Studie zeigte 100 % Ethanolextrakt eine Reduzierung um 14,02 % bei 3 µg/ml, und 70 % Ethanolextrakt wurde bei derselben Dosis um 19,28 % reduziert. Darüber hinaus wurde bei einer Konzentration von 10 µg/ml eines 100 %igen Wasserextrakts die Anzahl der TRAP-positiven BMCs pro Vertiefung um 53,53 % reduziert, was eine deutlich höhere Hemmwirkung auf die Differenzierung von Osteoklasten im Vergleich zu anderen Extrakten bei gleicher Dosis zeigt. Keiner der mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assay bewerteten Testextrakte zeigte signifikante zytotoxische Wirkungen gegen BMCs bei 1–20 μg/ml (ergänzende Abbildung S1). Wir verwendeten LC-MS, um Verbindungen der drei verschiedenen Extrakte zu finden. Im hydrothermischen Extrakt wurde auffällig ein scharfer Peak (15,53 min) gefunden, der in den Extrakten mit 70 % und 100 % Ethanol selten zu sehen war (Abb. 1B). 1H-NMR-, 13C-NMR-, COSY-, HSQC- und HMBC-Spektren wurden zur Identifizierung und Reinigung der Verbindung verwendet (Ergänzende Abbildungen 2–5).

(A) Auswirkungen von UmHb-Extrakten (1, 3 und 10 µg/ml) auf die RANKL-induzierte Osteoklastendifferenzierung. Es wurden TRAP-positive MNCs (Kernzahl > 3) gezählt. (B) Vergleich von LC-MS-Chromatogrammen von UmHb-Extrakten (1 mg/ml), die mit verschiedenen Lösungsmitteln erhalten wurden. Ein hochintensiver Peak wurde im Wasserextrakt bei 15,53 Minuten beobachtet, jedoch nicht im Extrakt mit 70 % oder 100 % Ethanol. (C) Identifizierte Verbindung E7A ((2R,3R)-Epicatechin-7-O-β-D-apiofuranosid). Die Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 im Vergleich zum Vehikel (Positivkontrolle) gemäß Student-t-Test. Maßstabsbalken, 500 μm.

Die isolierte Verbindung aus dem hydrothermischen UmHb-Extrakt (Abb. 1C) bestand aus einem Flavan-3-ol-Aglycon und einer Zuckereinheit und zeigte UV-Absorptionen bei 203 nm (Maximum) und 280 nm (Maximum). Seine Summenformel C20H22O10 wurde durch positive und negative ESI-MS-Molekülionenpeaks bei m/z 423 [M + H]+ bzw. 421 [M − H]− reduziert. Das 1H-NMR-Spektrum ergab zwei überlappende aromatische Singuletts bei δ 6,13 für H-6 und H-8 aus einem 1,2,3,5-tetrasubstituierten Benzolring und drei aromatische Signale bei δ 6,98, 6,80 und 6,76 aus einem ABX-Spinsystem. Das Protonensignal von H-2 wurde als breites Singulettsignal bei δ 4,82 in Methanol-d4 und als Dublett bei δ 4,72 mit einer kleinen Kopplungskonstante von 3,5 Hz in DMSO-d6 beobachtet, was eine relative 2,3-cis-Konfiguration zeigte . Eine absolute 2R-, 3R-Konfiguration wurde durch die optische Drehung von − 19,6 ([α]22D) nahegelegt. Die verbleibenden fünf aliphatischen Protonensignale wurden bei δ 5,49, 4,14, 4,09, 3,85 und 3,62 beobachtet, was auf das Vorhandensein einer D-Apiofuranose schließen lässt. Die β-Zuckerbindung wurde anhand der Kopplungskonstante (J = 2,9 Hz) des anomeren Protons der Apiofuranose-Einheit bestimmt. Die 7-O-Bindung der Zuckereinheit an C-7 wurde durch die HMBC-Korrelationen von H-1'' zu seinen benachbarten Kohlenstoffatomen C-6, C-7 und C-8 bestätigt. Diese Verbindung wurde als Epicatechin-7-O-β-D-apiofuranosid (E7A) identifiziert.

BMCs wurden drei Tage lang mit 10 ng/ml RANKL und 30 ng/ml M-CSF kultiviert, um Präosteoklasten zu erzeugen. Präosteoklasten wurden durch Inkubation mit M-CSF (30 ng/ml) für 30 Minuten und RANKL (10 ng/ml) für einen weiteren Tag in TRAP-positive reife mehrkernige Osteoklasten (TRAP+MNCs) differenziert12,13. Während dieses Inkubationsschritts wurden Vehikel oder isolierte Verbindungen hinzugefügt. Nach einem Tag wurden die Osteoklasten fixiert und mit einem Kit gefärbt, um die Aktivität zu berechnen. Die aus dem Heißwasserextrakt isolierte Verbindung wurde als E7A identifiziert. Als nächstes wurde die Fähigkeit der neu entdeckten Verbindung E7A, die Differenzierung von Osteoklasten zu reduzieren, mit der von Ulmosid A, der wirksamsten Verbindung im Ethanolextrakt von UmHb, und mit der von Catechin, das allgemein als Hauptbestandteil von angesehen wird, verglichen Rinde von Bäumen der Gattung Ulmus. TRAP wurde aufgrund seiner hohen Expression in aktivierten Osteoklasten als primärer Marker verwendet. Wie in Abb. 2A gezeigt, zeigten Ulmosid A und E7A eine starke Hemmwirkung gegen die RANKL-induzierte Differenzierung von BMCs in reife Osteoklasten, wohingegen Catechine keine Wirkung hatten. Ulmoside A und E7A hemmten die RANKL-induzierte BMC-Differenzierung um 23,43 % bzw. 47,13 % bei 10 μM (Abb. 2A). Die wirksamste Verbindung, E7A, hemmte dosisabhängig die RANKL-induzierte Osteoklastendifferenzierung, wenn sie in Konzentrationen von nur 1 μM getestet wurde (Abb. 2A). Die IC50-Daten von Ulmosid A und E7A betrugen 10,3 μM und 6,6 μM, wie in Abb. 2 dargestellt. Keine der mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assay bewerteten Testverbindungen zeigte bei 20 μM signifikante zytotoxische Wirkungen gegen BMCs (Ergänzende Abbildung S6).

(A) Auswirkungen von E7A (1, 10 und 20 µM) auf die RANKL-induzierte Osteoklastendifferenzierung. Als Positivkontrollen wurden Ulmoside A (UA) und Catechin (CA) verwendet. (B) Verschiedene Rinden der Gattung Ulmus wurden unter den gleichen Bedingungen extrahiert und der E7A-Gehalt in den Extrakten wurde bei einer Retentionszeit von 15,53 Minuten durch LC-MS-Chromatographie nachgewiesen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 im Vergleich zum Vehikel (Positivkontrolle) gemäß Student-t-Test. Maßstabsbalken, 500 μm.

Wie oben beschrieben haben wir festgestellt, dass das Glykosid-Flavonoid E7A aus dem hydrothermischen Extrakt von UmHb die Differenzierung von Osteoklasten am wirksamsten hemmt. Als nächster Schritt wurde ein Experiment durchgeführt, um den Gehalt an E7A in den Rinden verschiedener Ulmus-Arten zu untersuchen, die gemischt und auf dem Markt verkauft wurden. Diese Rinden wurden unter den gleichen Bedingungen aus vorbehandelten Trockenproben extrahiert. Die extrahierten Lösungsproben wurden mittels LC/MS analysiert. In allen Extrakten mit Ausnahme des U. davidiana var japonica Nakai-Extrakts wurde bei 15,53 Minuten ein UV-Signalpeak (210 nm) festgestellt (Abb. 2B). MS-Experimente wurden am Peak bei 15, 53 Minuten durchgeführt, um die Genauigkeit der qualitativen Experimente zu verbessern (ergänzende Abbildung S7). E7A, das wir als Standard und Wirkstoff ausgewählt haben, ergab Peaks bei m/z 423 [M + H]+ und 421 [M − H]−. Die MS-Ergebnisse zeigten einen Peak bei 423,150 m/z nur in den U. pumila- und UmHb-Extrakten. Unter Verwendung der HPLC-Standardkurvenmethode wurde der Gehalt an E7A (mg) pro Extrakt (g) mit 5,54 mg/g im U. pumila-Extrakt und 17,28 mg/g im UmHb-Extrakt gemessen, was einem etwa 3,12-fachen Unterschied entspricht .

Die Hemmung der Genexpression, die an der RANKL-induzierten Osteoklastendifferenzierung beteiligt ist, durch E7A wurde mithilfe von Echtzeit-qPCR analysiert. Wenn RANKL-aktivierte BMCs mit 20 µM E7A behandelt wurden, wurde die mRNA-Expression von NFATc1, TRAP, CTSK, OSCAR und DC-STAMP ab Tag 1 und 3 signifikant unterdrückt (Abb. 3A). Zusätzlich zur Echtzeit-qPCR der mRNA-Expression verschiedener an der Osteoklastendifferenzierung beteiligter Gene führten wir einen Resorptionsgrubentest durch, um die Wirkung von E7A auf die Knochenresorptionsfunktion reifer Osteoklasten zu untersuchen. Das Ausmaß der Vertiefungen nahm in RANKL-behandelten BMCs abhängig von der E7A-Konzentration ab (Abb. 3B).

(A) Wirkung von E7A auf die RANKL-induzierte mRNA-Expression osteoklastenspezifischer Gene. Die mRNA-Expressionsniveaus von NFATc1, TRAP, DC-STAMP, OSCAR und Cathepsin K (CTSK) wurden durch Echtzeit-qPCR gemessen. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. (B) Resorptionsgrubentest für Osteoklasten. BMCs (6 × 104 Zellen/Well) wurden in einer 24-Well-Gewebekulturplatte in α-MEM mit 30 ng/ml M-CSF mit oder ohne 10 ng/ml RANKL in Abwesenheit oder Anwesenheit von E7A (1, 3) kultiviert , 10 oder 20 μM) für 4 Tage. Am 4. Tag wurden nach dem Entfernen des Mediums 100 µL 10 %ige Bleichlösung hinzugefügt. Der Resorptionsbereich wurde mit einem Lichtmikroskop (100-fache Vergrößerung) beobachtet und mit der Image J-Software gemessen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 im Vergleich zum 0-Tag nach Student-t-Test. Maßstabsbalken, 500 μm.

Vier unabhängige Variablen (Temperatur, pH-Wert, Zeit und Lösungsmittelverhältnis) wurden berücksichtigt, um die besten Bedingungen für die Gewinnung des E7A-reichen UmHb-Extrakts zu bestimmen. RSM wurde verwendet, um die Interaktionseffekte mehrerer unabhängiger Variablen auf die Antwort statistisch zu analysieren14, und die Polynomgleichung zweiter Ordnung wurde verwendet:

Tabelle 1 zeigt die Varianzanalyse (ANOVA) der RSM-Modelle für die Antwort. Die Ergebnisse zeigten, dass das quadratische Modell signifikant war (P < 0,05) mit einem nicht signifikanten Mangel an Anpassung (P > 0,05).

Die Auswirkungen der Extraktionsparameter auf den E7A-Gehalt aus UmHb-Extrakten sind in Abb. 4 mit einem dreidimensionalen Reaktionsoberflächendiagramm dargestellt. Die optimalen Extraktionsbedingungen zur Maximierung des E7A-Gehalts im UmHb-Extrakt waren 100 ml/g, 90 °C, pH 5 und 97 Minuten. Die Ausbeute an E7A wurde auf 26,05 mg/g Extrakt mit einem wünschenswerten Wert von 0,856 vorhergesagt. Die dreifachen Experimente bestätigten den vorhergesagten Zustand mit einem Wert von 26,05 ± 0,96 mg E7A/g Extrakt.

Dreidimensionale Oberflächendiagramme, die die Auswirkungen des Lösungsmittel-zu-Feststoff-Verhältnisses, der Temperatur, des pH-Werts und der Extraktionszeit auf den E7A-Gehalt in UmHb-Extrakten zeigen. (A) Messung der Menge an E7A mit Verhältnis und Temperatur als Parametern. (B) Verhältnis und pH-Wert, (C) Verhältnis und Zeit, (D) Temperatur und pH-Wert, (E) Temperatur und Zeit und (F) Zeit und pH-Wert als unabhängige Variablen.

Um die hemmende Wirkung des optimierten UmHb-Extrakts auf die RANKL-induzierte Osteoklastendifferenzierung zu untersuchen, wurden BMCs mit M-CSF und RANKL in Abwesenheit oder Gegenwart des Extrakts behandelt. Es wurden TRAP-Färbung, Echtzeit-qPCR, Western Blot und Pit-Assays durchgeführt (Abb. 5). Den Ergebnissen der TRAP-Färbung zufolge wurde die Osteoklastendifferenzierung proportional zur Konzentration des Extrakts gehemmt und die Differenzierung in TRAP+MNCs wurde durch die Extraktbehandlung deutlich reduziert. Die mRNA-Expression von Genen, die mit der Differenzierung von Osteoklasten zusammenhängen, wurde ebenfalls untersucht. Die Behandlung von BMCs mit 20 µg/ml Extrakt reduzierte die mRNA-Expression von NFATc1, TRAP, DC-STAMP, CTSK und OSCAR signifikant (Abb. 5B). Darüber hinaus reduzierte der Extrakt die Proteinexpression von NFATc1 (Abb. 5C), einem Hauptregulator der Osteoklastendifferenzierung, erheblich15.

(A) Die RANKL-vermittelte Osteoklastogenese wurde durch optimierte UmHb-Extrakte unterdrückt, die keine zytotoxischen Wirkungen hatten. TRAP-positive MNCs (Kernzahl > 3) wurden gezählt (n = 3). (B) Auswirkungen des optimierten UmHb-Extrakts auf die RANKL-induzierte mRNA-Expression osteoklastenspezifischer Gene. (C) Wirkung des optimierten UmHb-Extrakts auf die Proteinexpression des Osteoklasten-spezifischen Transkriptionsfaktors NFATc1. (D) Resorptionsgrubentest für Osteoklasten. BMCs wurden auf einer Gewebekulturplatte ausplattiert und in α-MEM mit 30 ng/ml M-CSF mit oder ohne 10 ng/ml RANKL in Abwesenheit oder Anwesenheit optimierter UmHb-Extrakte (1, 3, 10 oder 20 μg/ml) kultiviert ) für 4 Tage. Am 4. Tag wurden nach dem Entfernen des Mediums 100 µL 10 %ige Bleichlösung hinzugefügt. Der Resorptionsbereich wurde mit einem Lichtmikroskop (100-fache Vergrößerung) beobachtet und mit der Image J-Software gemessen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 im Vergleich zu den 0 Tagen gemäß Student's t-Test. Maßstabsbalken, 500 μm.

Zuvor haben wir veröffentlicht, dass ein Ethanolextrakt von UmHb eine antiosteoklastogene Aktivität aufweist12. Da UmHb traditionell als Tee konsumiert und über einen längeren Zeitraum als pflanzliches Arzneimittel verwendet wurde, gingen wir davon aus, dass es auch in hydrothermalen Extrakten wirksam sein würde. Wir haben seine Wirksamkeit bei der Hemmung der Osteoklastendifferenzierung entsprechend den Bedingungen des Extraktionslösungsmittels bestätigt. Als Ergebnis untersuchten wir, dass die Wirkung der Hemmung der Osteoklastendifferenzierung in hydrothermalen Extrakten besser war, und wir stellten die Hypothese auf, dass im Gegensatz zu Ethanolextrakten spezifische Verbindungen in hydrothermalen Extrakten vorhanden sein würden (Abb. 1A). Beim Vergleich der HPLC-Daten der drei Extrakttypen wurde ein Peak (15,53 min) nur in hydrothermalen Extrakten gefunden, und es wurde erwartet, dass die an dieser Stelle vorhandene Substanz die spezifische Hemmwirkung auf die Osteoklastendifferenzierung in hydrothermalen Extrakten haben würde (Abb. 1B).

Wir führten ein Vergleichsexperiment mit E7A, einer spezifischen Verbindung hydrothermaler UmHb-Extrakte, und UA, der wirksamsten Verbindung im Ethanolextrakt, und Catechin, einer repräsentativen Grundgerüststruktur des Hance-Rindenflavonoids von U. Macrocarpa, durch. Wie aus den Ergebnisdaten hervorgeht, zeigte E7A im Vergleich zu anderen Verbindungen eine überlegene Leistung und stellt eine Schlüsselsubstanz bei der Hemmung der Osteoklastendifferenzierung dar (Abb. 2A). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass E7A die Knochenresorptionsfunktion wirksam hemmt und die Regulierung der NFATc1-Expression ein wichtiger Mechanismus für diese Wirkung von E7A ist. Darüber hinaus war Catechin (eine häufige Rückgratstruktur) bei der Hemmung der Osteoklastendifferenzierung nicht wirksam. Aber Ulmosid A, ein an Glykosid gebundenes Catechin, hat Wirkungen, wenn auch weniger wirksam als E7A. Dies bedeutet, dass Glykosidrückstände voraussichtlich auch eine sehr wichtige Rolle für die Wirksamkeit spielen.

Und beim Vergleich von Flavan-3-ol((−)-Epigallocatechin, (−)-Epigallocatechingallat und (−)-Epicatechingallat (EGC)), das bei der Osteoklastendifferenzierung von grünem Tee und E7A mit Struktur-Funktions-Beziehung wirksam ist, Der 2. und 3. Kohlenstoff von Flavan-3-ol haben einen gemeinsamen Punkt der (R, R)-Konfiguration. Unter den Flavonoiden von Grüntee-Extrakten war EGC das wirksamste bei der Hemmung der Osteoklastendifferenzierung, und (−)-Epigallocatechin und (−)-Epigallocatechingallat haben eine relativ geringe Wirkung16. Obwohl die Kohlenstoffbindung eine (R,S)-Konfiguration aufweist, wurde bestätigt, dass Catechin in dieser Studie unwirksam war. Darüber hinaus deuten frühere Studien darauf hin, dass die Wirksamkeit von Catechin-7-OD-Apiofuranosid nur aus (R,S)-Konfigurationsvarianten besteht, im Vergleich zu E7A, das aus (R,R)-Konfigurationsstrukturen besteht12.

E7A ist eine Struktur, die Epicatechin von Flavan-3-ol-Strukturen mit (R, R)-Konfiguration enthält und eine ähnliche IC50-Hemmwirkung wie EGCG (6,6 mM) zeigt, das die beste Hemmwirkung auf die Osteoklastendifferenzierung von grünem Tee aufweist, was im Einklang mit steht die obige Logik17. Durch die Auflistung der obigen Ergebnisse kann bestätigt werden, dass die (R,R)-Konfigurationsbindungsstruktur eine Schlüsselrolle bei der Hemmung der Osteoklastendifferenzierung spielt. Es wurde daher erwartet, dass die hemmende Wirkung auf die Differenzierung von Osteoklasten nicht nur durch die Grundgerüststruktur der Catechine beeinflusst wird, sondern auch durch die Position oder Art der zusätzlich gebundenen Glykoside.

Im Bereich der Naturstoffstudien wird häufig beobachtet, dass Arten innerhalb derselben Gattung ähnliche Biosynthesemechanismen aufweisen. Vor diesem Hintergrund haben wir untersucht, ob UmHb die optimale Wahl für die Extraktion von E7A ist. Wir haben fünf in Korea beheimatete Arten der Gattung Ulmus gesammelt und ihren E7A-Gehalt unter den gleichen Extraktionsbedingungen analysiert. E7A wurde in den meisten Bäumen in geringen Mengen nachgewiesen, wobei die höchste Konzentration in Ulmus Macrocarpa Hance gefunden wurde. Basierend auf diesen Ergebnissen kamen wir vorläufig zu dem Schluss, dass UmHb das am besten geeignete Material ist, um eine hohe Reinheit und effiziente Extraktion von E7A zu erreichen. Es ist schwierig, den Effekt der Hemmung der Osteoklastendifferenzierung von E7A nur mit dem TRAP-Assay zu schließen, und dies wurde durch Bioassays mit verschiedenen Methoden nachgewiesen. Als zu bestätigende Gene wurden NFATc1, TRAP, DC-STAMP, OSCAR und CTSK ausgewählt. Der Knochenstoffwechsel wird durch ein komplementäres Gleichgewicht zwischen den Osteoblasten, die die Knochenmatrix bilden, und den Osteoklasten, die Knochen absorbieren, erreicht18. Osteoklasten entstehen durch Proliferation, Differenzierung, Fusion und Aktivierung, beginnend mit hämatopoetischen Stammzellen19,20. Die von Osteoblasten freigesetzten Zytokine Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) und Rezeptoraktivatoren des Kernfaktor-κB-Liganden (RANKL) spielen eine wesentliche Rolle bei der Differenzierung und Erzeugung von Osteoklasten in hämatopoetischen Stammzellen21. In Gegenwart von M-CSF ermöglicht der Interleukin-1-vermittelte autokrine Mechanismus, dass Osteoklasten mit der Knochenmatrix interagieren22, was letztendlich zu einem erhöhten Plasmakalziumspiegel führt. Das freigesetzte RANKL bindet an seinen Rezeptor RANK, der über M-CSF-Stimulation auf der Oberfläche von Osteoklasten-Vorläuferzellen exprimiert wird. Wenn Osteoklasten-Vorläuferzellen mit ihrem Oberflächenrezeptor (RANK) an RANKL binden, aktivieren diese Zytokine wichtige Signale, die auf Osteoklastenaktivität durch verschiedene Adapterproteine und Kinasen hinweisen23,24.

In den frühen Stadien der RANK-Signalübertragung wird RANKL über Adapterproteine wie TRAF6 (das Hauptadapterprotein, das für die Vermittlung von Signalkaskaden verantwortlich ist, die durch RANKL aktiviert werden)25 an den zytoplasmatischen Schwanz von RANK rekrutiert, was zur schnellen Aktivierung von MAPKs führt. NF-κB und Aktivatorprotein-1 (AP-1)26. Im nächsten Schritt des Signalprozesses wird Zytoplasma 1 (NFATc1), ein Kernfaktor aktivierter T-Zellen und ein wichtiger Regulator der Osteoklastogenese, durch die orchestrierte Signalübertragung von aktiviertem AP-1 und kostimulatorischer signalvermittelter intrazellulärer Ca2+-Oszillation27 verstärkt . Im letzten Schritt dient das von NFATc1 transkribierte osteoklastogene Gen als Mediator zur Regulierung der Multinukleation und der Knochenabsorption im Zellkern24. In einer früheren Studie haben wir herausgefunden, dass Flavonoidglykoside im UmHb-Ethanolextrakt die RANKL- und M-CSF-induzierte Osteoklastendifferenzierung in BMCs durch die Expression von NFATc112 hemmen. NFATc1 ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor und reguliert die Expression zahlreicher Zielgene für die Differenzierung von Osteoklasten, darunter TRAP, Cathepsin K (CTSK), Osteoklasten-assoziierter Rezeptor (OSCAR) und dendritisches zellspezifisches Transmembranprotein (DC-STAMP)15. TRAP ist ein in Osteoklasten stark exprimiertes Protein, das als Indikator für die Osteoklastenbildung verwendet werden kann28. CTSK, das an der Knochenresorption beteiligt ist, ist für den Abbau von Kollagen Typ I während der Osteoklasten-vermittelten Knochenresorption verantwortlich29. DC-STAMP und OSCAR sind am Multinukleationsprozess durch Zell-Zell-Fusion mononukleärer Osteoklasten während der Osteoklastendifferenzierung beteiligt30,31.

In der PCR-Technik wurde das Ergebnis, dass E7A die Osteoklastendifferenzierung im Vergleich zur Kontrolle hemmt, in NFATc1, TRAP, DC-STAMP, OSCAR und CTSK bestätigt. Dieses Ergebnis lieferte einen Hinweis darauf, dass die Differenzierung nicht nur im TRAP-Assay, sondern auch auf genetischer Ebene unterdrückt wurde (Abb. 3A). Da diese Faktoren auch als Indikatoren zur Bestätigung der Fähigkeit zur Hemmung der Osteoklastendifferenzierung in verschiedenen In-vivo-Experimenten verwendet werden, ist mit der Möglichkeit positiver Ergebnisse sowohl in Tierversuchen als auch in In-vitro zu rechnen. Die Osteoklasten zerstören Knochengewebe und bilden ein dreidimensionales Loch in der Knochenoberfläche, das in vitro als „Resorptionsgrube“ bezeichnet wird. Studien zur Osteoporose haben den Grad der Resorption anhand der Größe und Tiefe der Resorptionsgrube untersucht32. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass E7A selbst im Pit-Assay eine konzentrationsabhängige Wirkung auf die Hemmung der Osteoklastendifferenzierung hat. Bei der Differenzierung von Osteoblasten war die Aktivität leicht erhöht, wenn BMP-2 (100 ng/ml) mit E7A behandelt wurde (ergänzende Abbildung S10). Infolgedessen hemmt E7A die Differenzierung in Osteoklasten unabhängig vom Osteoblastenmechanismus.

Um den effizientesten E7A-reichen Extrakt zu erhalten, wurden pH-Wert, Temperatur, Verhältnis und Zeit als unabhängige Variablen angeordnet. Unter den Variablen erwiesen sich die Auswirkungen von Temperatur und pH-Wert sowie die Wechselwirkung zwischen ihnen mit einem Bestimmtheitsmaß (R2) von 0,8513 als signifikant. Eine Erhöhung der Temperatur führt zu einer Erhöhung des Diffusionskoeffizienten und der Löslichkeit von Flavonoiden sowie zu einer deutlichen Erhöhung der Solvatisierung und des Stofftransfers33. Darüber hinaus kann die erhöhte Temperatur durch den Abbau von Zellstrukturen die Freisetzung von Flavonoiden aus Pflanzen auslösen34. Es wurde berichtet, dass saure Bedingungen die Extraktionseffizienz von Polyphenolen wie Anthocyanidin-3-glucosiden beeinflussen35,36. Wir haben bestätigt, dass der optimierte E7A-reiche Extrakt von UmHb die Fähigkeit zur Hemmung der Osteoklastendifferenzierung zeigte. Die Extrakte hatten bei den in diesem Experiment verwendeten Konzentrationen (1–20 µg/ml) keine zytotoxische Wirkung auf BMCs, was darauf hinweist, dass die Hemmung der Osteoklastendifferenzierung nicht auf die Zytotoxizität des Extrakts zurückzuführen ist (Abb. 5A). Optimierte Extrakte zeigten eine signifikante Hemmwirkung auf die Osteoklastendifferenzierung sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene (Abb. 5B, C). Der resorptive Grübchentest ergab, dass der Extrakt das Ausmaß des Grübchens dosisabhängig reduzierte (Abb. 5D). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass der optimierte UmHb-Extrakt die Osteoklastendifferenzierung und die Knochenresorptionsfunktion reifer Osteoklasten durch die Herunterregulierung der NFATc1-Expression verringert. UmHb fördert die Differenzierung von Osteoblasten durch BMP-2. Es ist zu erkennen, dass die Aktivität bei einer Konzentration von 20 µg/mL zunimmt (Ergänzende Abbildung S10). Beim Vergleich der IC50-Werte des UmHb-Hydrothermalextrakts (berechnet aus den Daten in Abb. 1A) und des optimierten Hydrothermalextrakts (Abb. 5) wurde der IC50-Wert von 3,57 auf 3,17 µg/ml gesenkt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die hemmende Wirkung der Osteoklastendifferenzierung durch die Erhöhung des Gehalts des Wirkstoffs E7A durch unseren Optimierungsprozess verstärkt wurde (ergänzende Abbildung S8). Diese E7A-reichen Extrakte zeigen Potenzial als Ergänzung zur Verbesserung/Behandlung von Knochenerkrankungen.

Diese Studie untersuchte die Wirksamkeit von Wasserextrakten, da Menschen seit vielen Jahren traditionell UmHb-Tee als Kräutermedizin trinken. UmHb-Heißwasserextrakt hemmte die Osteoklastendifferenzierung wirksamer als Ethanolextrakt. (2R,3R)-Epicatechin-7-O-β-D-apiofuranosid (E7A) wurde als eine Substanz identifiziert und gereinigt, die im Wasserextrakt ausreichend vorhanden war und in Extrakten mit 70 % und 100 % Ethanol selten zu sehen war. Das Glykosid-Flavonoid E7A hemmte die RANKL-induzierte Osteoklastendifferenzierung signifikant, und die Hemmwirkung war größer als die von Ulmosid A, der wirksamsten Verbindung im Ethanolextrakt von UmHb. Um die Extraktion von E7A zu verbessern, haben wir mithilfe von RSM optimale Extraktionsbedingungen für UmHb festgelegt. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass E7A und sein optimaler Extrakt die Differenzierung von Osteoklasten aufheben, indem sie die Expression von NFATc1 sowie anderen Zielgenen im Zusammenhang mit der Differenzierung von Osteoklasten hemmen. Die Ergebnisse unserer Forschung wurden in einem Flussdiagramm zusammengefasst, das in Abb. 6 dargestellt ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass E7A und sein optimaler Extrakt das Potenzial haben, als Substanzen entwickelt zu werden, die Osteopenie-Erkrankungen verbessern/verhindern können. Zukünftige präklinische und klinische In-vivo-Studien sind erforderlich, um zu untersuchen, ob und durch welchen Mechanismus E7A und optimaler UmHb-Extrakt die Osteopenie-Erkrankung hemmen.

Fassen Sie die gesamte Studie zusammen.

Das ultraviolette (UV) Spektrum wurde mit einem Hitachi JP/U-3010 UV-Spektrophotometer (Tokio, Japan) erhalten. Alle NMR-Spektren wurden mit einem Bruker Ascend 700-Spektrometer (Billerica Middlesex County, MA, USA) unter Verwendung von MeOH-d4 (Gif-sur-Yvette, Frankreich) als Lösungsmittel aufgenommen. NMR-Lösungsmittel wurden vom Cambridge Isotope Laboratory (Andover, MA, USA) gekauft.

Chemische Verschiebungen wurden durch Bezugnahme auf jeden Lösungsmittelpeak erhalten (HH 3,31 und CC 49,0 für Methanol-d4). LC-MS-Daten mit niedriger Auflösung wurden mit einer HPLC der Agilent Technologies 1200-Serie (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) erfasst, die an ein Quadrupol-Massenspektrometer Agilent Technologies 6130 angeschlossen war. Hochauflösende MS-Daten wurden mit einem hochauflösenden Triple TOF 5600-Massenspektrometer (AB Sciex, Foster City, CA, USA) mit einem Quadrupol/TOF-Massenspektrometer aufgezeichnet. Alle Massendaten wurden mit der Elektronenspray-Ionisationsmethode (ESI) ermittelt.

Getrocknetes UmHb wurde von einem lokalen Unternehmen (Jinsung FM) gekauft. U. pumila L, U. parvifolia Jacq, U. davidiana Planchon und U. davidiana var. japonica (Rehder) Nakai wurden von Seoul National University Forests (SNUF) zur Verfügung gestellt und ihre Identität wurde von einem der Co-Autoren dieser Arbeit, Ki Won Lee12, bestätigt. Diese Studie entspricht den einschlägigen Gesetzen sowie internationalen, nationalen und institutionellen Richtlinien. Das Pflanzenmaterial wurde in einer Trockenkammer bei kontrollierter Temperatur von 50 °C, relativer Luftfeuchtigkeit und Luftgeschwindigkeit dehydriert, um die Qualität des Endprodukts sicherzustellen. Die getrocknete Rinde wurde in kleine Stücke geschnitten und mit einem Mixer zu einem feinen Pulver gemahlen. Anschließend wurde es von Hand gepflückt und zu einem feinen Pulver (~ 20 Mesh) zerkleinert. Die pulverisierten Proben wurden dann in einen entsprechend gekennzeichneten Polypropylen-Reißverschlussbeutel überführt und maximal 30 Wochen lang bei –80 °C aufbewahrt.

Dreihundert Milligramm pulverförmige Proben wurden zu 30 ml destilliertem Wasser bei 70 °C gegeben und nach dem Suspendieren 120 Minuten lang extrahiert. Die extrahierte Lösung wurde 1000 s lang bei Raumtemperatur mit 3000 × g zentrifugiert und der Überstand durch Whatman-Filterpapier Nr. 4 filtriert.

Getrocknetes UmHb-Pulver (50 g) wurde 3 Stunden lang mit entionisiertem Wasser bei 70 °C extrahiert. Der getrocknete Wasserextrakt (312,5 mg) wurde in destilliertem Wasser (250 ml) resuspendiert und die Lösung nacheinander mit Dichlormethan (250 ml), Ethylacetat (250 ml) und n-Butanol (250 ml) fraktioniert. Die n-Butanolschicht wurde einer Größenausschlusschromatographie mit Sephadex LH-20 unterzogen und mit Methanol eluiert, um 46 Fraktionen (UMB1–UMB46) zu erhalten. Die Fraktionen UMB13-46 enthielten ähnliche chemische Komponenten. Daher wurden die Fraktionen UMB13–46 kombiniert und durch RP-HPLC (Phenomenex Luna C18, 5 μm, 100 Å, 250 × 100 mm) gereinigt, wobei mit 35 % MeOH eluiert wurde, und nur eine Verbindung isoliert wurde (RT: 15,53 min; 13,5 mg). im Wasserextrakt.

(2R,3R)-Epicatechin-7-O-β-D-apiofuranosid (E7A) weißes und braunes amorphes Pulver; [α]20D –19,6 (c 0,52, MeOH); UV (MeOH) λ max (log ε) 203, 278; 1H-NMR (Methanol-d4, 700 MHz) δ 6,98 (d,J = 1,7 Hz, H-2′), 6,80 (dd, J = 8,1, 1,7 Hz, H-6′), 6,76 (d,J = 8,1 Hz, H-5′), 6,14 (d, J = 3,8 Hz, 1H, H6), 6,14 (d, J = 3,8 Hz, 1H, H8), 4,82 (br s, H-2), 4,19 (m, H-3), 2,88 (dd, J = 16,8, 4,4 Hz, H-4a), 2,74 (dd, J = 16,8, 2,6 Hz, H-4b), 2,88 (H-4a), 2,74 (H-4b) , 2,86 (H-4a), 2,54 (H-4b), 5,49 (d, J = 2,9 Hz, H-1″), 4,14 (d, J = 2,9 Hz, H-2″), 4,09 (m, H -4″a), 3,85 (d, J = 9,7 Hz, H4″b), 3,62 (m, H-5″), 5,49 (d, J = 2,9 Hz, H-1″); 13C NMR (Methanol-d4, 175 MHz) δ 108,72 (C-1″), 79,94 (C-3″), 78,27 (C-2″), 75,40 (C-4″), 64,96 (C-5″) , 158,01 (C-7), (C-C1′), 119,36 (C-6′), 115,90 (C-5′), 115,28 (C-2′), 102,51 (C-10), 97,40 (C- 6), 97,17 (C-8), 80,29 (C-2), 67,29 (C-3), 29,27 (C4); ESI MS m/z 423 [M + H] + , 421 [M − H]−.

Der Extrakt und die Verbindungen wurden mit einem Waters HPLC-System (Milford Worces County, MA, USA) analysiert, das mit einem Waters 2998 Photodiodenarray-Detektor auf einer HPLC Phenomenex Luna C18-Säule (5 μm, 100 Å, 250 × 100 mm2) ausgestattet war. Die Temperatur der Säule wurde bei 24 °C gehalten. Die Chromatogramme wurden bei 210 nm verarbeitet und die Spektren wurden zwischen 210 und 400 nm erhalten. Ein Gradientenlösungsmittelsystem bestehend aus Lösungsmittel A (0,1 % (v/v) wässrige Ameisensäure) und Lösungsmittel B (0,1 % (v/v) Ameisensäure in Acetonitril) wurde mit 1 ml/min wie folgt verwendet: 0–2 min. 2 bis 25 % B; 2–20 Minuten, 50 bis 95 % B. Für die HPLC-Analyse wurden Lösungsmittel in HPLC-Qualität (Daejeon, Korea) verwendet.

Die Differenzierung der Osteoklasten und die TRAP-Färbung wurden wie zuvor berichtet durchgeführt12,13. Wir haben Knochenmarkszellen (BMCs) gemäß dem Animal Research Standard Protocol (SCNU) der Suncheon University isoliert. Das Tiernutzungsprotokoll wurde vom Agency Animal Care and Use Committee der SCNU genehmigt (Genehmigungsnr. SCNU IACUC 2021-05). Kurz gesagt, BMCs wurden durch Waschen der Oberschenkelknochen und Schienbeine einer 5 Wochen alten ICR-Maus mit PBS20 isoliert. Die isolierten BMCs wurden in α-MEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY, USA), mit 10 ng/ml M-CSF (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) kultiviert 1 T. BMCs, die durch Entfernung der suspendierten Zelltrümmer in α-MEM gewonnen wurden, wurden zur Osteoklastendifferenzierung verwendet. BMCs (1 × 104 Zellen/Vertiefung) wurden mit M-CSF (30 ng/ml) und RANKL (10 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 3 Tage lang kultiviert, um Präosteoklasten zu erzeugen. Die Präosteoklasten wurden entweder mit Vehikel oder den angegebenen Verbindungen in Gegenwart von M-CSF (30 ng/ml) 30 Minuten lang behandelt und dann mit RANKL (10 ng/ml) zur Differenzierung in reife TRAP-positive mehrkernige Zellen (TRAP+-) kultiviert. MNCs). Nach einem Tag wurden die Zellen 5 Minuten lang mit 3,7 % Formaldehyd fixiert, 5 Minuten lang mit 0,1 % Triton ). Es wurde bestätigt, dass alle im Experiment verwendeten Extraktproben bei einer Konzentration von 10 mg/ml vollständig bis zum Maximum gelöst waren (ergänzende Abbildung S9).

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Überwachung der Umwandlung von 2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, Mononatriumsalz (WST) zu Formazan beurteilt gemäß den Anweisungen des Herstellers (Dojindo, Kumamoto, Japan). Kurz gesagt, getrennte BMCs (1 × 104 Zellen/Well) wurden 12 Stunden lang in 96-Well-Platten in Gegenwart von M-CSF (30 ng/ml) inkubiert und dann mit den angegebenen Konzentrationen an Dimethylsulfoxid (DMSO)-Extrakten behandelt oder Flavonoidverbindungen. Nach 3 Tagen wurden 10 μl WST-8-Lösung in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und dann wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Thermo, Varioskan Flash, UK) gemessen.

Die Echtzeit-PCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt37. BMCs wurden mit M-CSF (30 ng/ml) in 10 % FBS α-MEM inkubiert und mit RANKL (10 ng/ml) für 0, 1, 2 oder 3 Tage in Gegenwart von E7A oder dem optimierten UmHb-Extrakt aktiviert . PCR-Primer-Sets (Tabelle 2) wurden mit dem Online-Programm Primer338 entworfen. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) isoliert und cDNA wurde unter Verwendung des M-MLV-cDNA-Synthesekits (Enzynomics, Daejeon, Korea) synthetisiert. Die PCR wurde unter Verwendung eines TOPreal qPCR 2 × PreMIX (Bio-Rad, Hercules, CA) in einem Echtzeit-PCR-Nachweissystem (Bio-Rad) durchgeführt. Die mRNA-Spiegel der Gene wurden mit der Methode \(2^{{{-}\Delta \Delta C_{T} }}\) bestimmt. Als interner Standard wurde Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) verwendet.

Die Western-Blot-Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt37. Kurz gesagt, BMCs wurden mit RANKL (10 ng/ml) und M-CSF (30 ng/ml) in 10 % FBS α-MEM für 0, 1, 2 oder 3 Tage in Gegenwart des optimierten UmHb-Extrakts inkubiert. Die geernteten Zellen wurden mit einem Lysepuffer, der Proteaseinhibitoren enthielt, lysiert und mithilfe des Bradford-Assays quantifiziert. Isolierte Proteine wurden mittels 10 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (Millipore, Bedford, MA, USA) übertragen. Die Membran wurde mit einem primären Antikörper (NFATc1) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Als Beladungskontrolle wurde β-Actin verwendet.

Um die hemmenden Aktivitäten von E7A und dem optimierten UmHb-Extrakt auf die Knochenresorptionsfunktion reifer Osteoklasten zu analysieren, wurde die Oberfläche für die Grübchenbildung analysiert. BMCs wurden mit 6 × 106 Zellen/Well in 24-Well-Gewebekulturplatten ausplattiert und mit 30 ng/ml M-CSF und 10 ng/ml RANKL in Gegenwart oder Abwesenheit von E7A oder dem optimierten UmHb-Extrakt 4 Tage lang kultiviert. Am 4. Tag wurden nach dem Entfernen des Mediums 100 µL 10 %ige Bleichlösung hinzugefügt. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und etwa 4 Stunden bei RT getrocknet. Einzelne Grübchen oder Ansammlungen mehrerer Grübchen wurden unter einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung beobachtet.

Die Maus-Myoblastenzelllinie C2C12 wurde von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erhalten. C2C12-Zellen wurden in 10 % FBS DMEM, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin gehalten. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 2,5 × 103 Zellen/Well ausgesät. Nach 4 Tagen wurden die Zellen differenziert, indem das Medium durch 10 % FBS DMEM und BMP-2 (100 ng/ml) durch E7A, den optimierten UmHb-Extrakt, in der angegebenen Dosis für 4 Tage ersetzt wurde. Die Bildung osteoblastischer Knochen wurde durch ALP-Färbung beobachtet.

Die Optimierung der wärmeunterstützten Extraktion (HAE) wurde an einem thermostatischen Heizgerät unter Verwendung eines versiegelten Gefäßes durchgeführt, um die Verdunstung des Lösungsmittels zu verhindern. Die zur Maximierung der E7A-Konzentration des UmHb-Extrakts verwendeten unabhängigen Variablen waren Extraktionszeit (t, 60–120 min), Temperatur (T, 50–90 °C), pH-Wert des Lösungsmittels (pH, pH 5–13) und Feststoff/ Flüssigkeitsverhältnis (S/L, 60–100 %). Die trockenen Pulverproben wurden mit 30 ml Lösungsmittel (destilliertes Wasser) gemischt und unter kontinuierlichem elektromagnetischem Rühren gemäß dem in Tabelle 1 dargestellten Versuchsaufbau verarbeitet. Nach der Extraktion wurde die Mischung zentrifugiert (3000 × g für 1000 s bei Raumtemperatur) und Der Überstand wurde durch Whatman-Filterpapier Nr. 4 filtriert. Die Konzentration von E7A wurde unter Verwendung von gereinigtem E7A (Reinheit 95,47 %, ergänzende Abbildung S10) in unserem Labor als Standard berechnet, das in gereinigter Form nicht im Handel erhältlich ist.

Box-Behnken-Design (BBD) mit unabhängigen Variablen [X1 (t, min), X2 (T, °C), X3 (pH) und X4 (S/L)] wurde angewendet, um die Extraktion von E7A aus UmHb zu optimieren HAE. Der BBD, einschließlich 29 unabhängiger Kombinationen mit 5 Replikaten im Zentrum des Versuchsdesigns, wurde ausgewählt, um die Vorhersagekapazität des Modells zu maximieren (Tabelle 1). Die vorhergesagte Reaktion (Y) wurde als Polynommodell zweiter Ordnung mit vier unabhängigen Variablen unter Verwendung der folgenden Gleichung ausgedrückt:

Dabei stellen Xi und

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wiederholungen dargestellt. Statistische Unterschiede wurden mithilfe des Student-t-Tests analysiert. Wahrscheinlichkeitswerte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen (P-Werte * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001).

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seiner ergänzenden Informationsdatei enthalten.

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Diese Arbeit wurde vom Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET) durch das High Value-added Food Technology Development Program unterstützt, finanziert vom Ministerium für Landwirtschaft, Ernährung und ländliche Angelegenheiten (MAFRA) (321029). -5), das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT finanzierte Grundlagenforschungsprogramm (2019R1A2C2005492), das Brain Korea 21 Plus-Programm des Department of Agricultural Biotechnology, Seoul National University, Republik Korea und das Korea Institute of Marine Science & Technology Promotion (KIMST), das vom Ministerium für Ozeane und Fischerei finanziert wird (20220488).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Chanhyeok Jeong, Yeon-Jin Cho und Yongjin Lee.

Abteilung für landwirtschaftliche Biotechnologie und Forschungsinstitut für Landwirtschaft und Biowissenschaften, Seoul National University, Seoul, 08826, Korea

Chanhyeok Jeong & Ki Won Lee

Bio-MAX-Institut, Seoul National University, Seoul, 08826, Korea

Yeon-Jin Cho, Chang Hyung Lee, Jung Han Yoon Park, Heonjoong Kang und Ki Won Lee

Abteilung für Pharmazie, Sunchon National University, 315 Maegok-dong, Suncheon, Jeollanam-do, 57922, Korea

Yongjin Lee & Young-Jin Son

Labor für Meeresdrogen, School of Earth and Environmental Sciences, Seoul National University, NS-80, Seoul, 08826, Korea

Weihong Wang, Kyu-Hyung Park, Eun Roh und Heonjoong Kang

Forschungsinstitut für Ozeanographie, Seoul National University, NS-80, Seoul, 08826, Korea

Weihong Wang & Heonjoong Kang

Interdisziplinäres Graduiertenprogramm für Gentechnik, Seoul National University, NS-80, Seoul, 08826, Korea

Heonjoong Kang

Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University, Suwon, 16229, Korea

Ki Won Lee

Institute of Green Bio Science and Technology, Seoul National University, Pyeongchang, 25354, Korea

Ki Won Lee

Abteilung für Agrarbiotechnologie und Zentrum für Lebensmittel- und Biokonvergenz, Seoul National University, Seoul, 08826, Korea

Ki Won Lee

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CHJ, YJC und YJL konzipierten und gestalteten das Konzept und verfassten das Hauptmanuskript. Die Vorbereitung der Materialien und des Extrakts wurde von CHJ durchgeführt. Die Optimierung der Extraktionsstudien wurde von YJC durchgeführt. Die hemmende Osteoklastendifferenzierung wurde von YJL und YJS durchgeführt. 1H-NMR-Spektroskopie und HPLC-Experimente wurden von WHW durchgeführt, und CHJKHP und ER beteiligten sich an HPLC-Experimenten und statistischen Analysen. Die Betreuung erfolgte durch CHL, YJHP, HJK und KWL

Korrespondenz mit Ki Won Lee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jeong, C., Cho, YJ., Lee, Y. et al. Entdeckung und optimierte Extraktion des antiosteoklastischen Wirkstoffs Epicatechin-7-O-β-D-apiofuranosid aus Ulmus Macrocarpa Hance-Rinde. Sci Rep 13, 11102 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38208-4

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Eingegangen: 20. Oktober 2022

Angenommen: 05. Juli 2023

Veröffentlicht: 09. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38208-4

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