Behandlungsstrategien für Schweinegülle zur Eindämmung der Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11999 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Aufgrund des Risikos, dass pathogene Antibiotika-resistente Bakterien und ihre Antibiotika-Resistenzgene vom Viehkot auf den Boden und die Kulturpflanzen übertragen werden, ist es unerlässlich, wirksame Güllebehandlungen auf dem Bauernhof zu finden, um dieses Gefahrenpotenzial zu minimieren. Eine weltweit eingeführte Politik der nachhaltigen Entwicklung, die sich auf eine ökologische landwirtschaftliche Produktion und die Kreislaufwirtschaft konzentriert und auf die Reduzierung des Einsatzes von Kunstdünger abzielt; Daher sollten solche Behandlungsmethoden auch den Düngewert von Tiermist maximieren. In dieser Studie werden zwei Strategien zur Verarbeitung von Schweinemist vorgeschlagen: Lagerung und Kompostierung. Die vorliegende Studie untersucht die Veränderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften von behandeltem Mist, im Mikrobiom und im Resistom im Vergleich zu Rohmist. Dies ist die erste derart umfassende Analyse, die an derselben Mistcharge durchgeführt wurde. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar keiner der Prozesse das Umweltrisiko beseitigt, die Kompostierung jedoch zu einer schnelleren und ausgeprägteren Reduzierung mobiler genetischer Elemente führt, die Antibiotikaresistenzgene beherbergen, einschließlich derjenigen, die für Multiresistenz verantwortlich sind. Insgesamt kann der Kompostierungsprozess eine effiziente Strategie sein, um die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen in der Umwelt einzudämmen und das Risiko ihrer Übertragung auf Nutzpflanzen und die Nahrungskette zu verringern und gleichzeitig wichtige Düngemittelbestandteile bereitzustellen.

Die wachsende Nachfrage nach Fleisch hat weltweit zu einem Anstieg der Schweinehaltung geführt. Die jährliche weltweite Schweineproduktion ist in den letzten 50 Jahren gestiegen und erreichte im Jahr 2018 etwa 120 Millionen Tonnen. Der gesamte Schweinefleischverbrauch wird im Jahr 2030 voraussichtlich um 13 % und im Jahr 2050 um 22 % im Vergleich zu 2020 steigen1. Die wichtigsten Schweinefleischproduzenten sind China ( 45 % der weltweiten Schweinefleischproduktion), gefolgt von den Vereinigten Staaten, Deutschland, Spanien und Vietnam2, wobei diese fünf Länder fast 65 % der weltweiten Schweinefleischproduktion ausmachen. Während Antibiotika in der EU nur zur Behandlung bakterieller Infektionen eingesetzt werden, werden sie in einigen anderen Ländern häufig auch zur Wachstumsförderung und Steigerung der Produktionseffizienz eingesetzt; In diesen Ländern werden jedes Jahr weltweit etwa 66.667 Tonnen Antibiotika bei Nutztieren eingesetzt3. Aufgrund des berichteten Zusammenhangs zwischen dem Einsatz von Antibiotika bei Nutztieren und der Entstehung von Antibiotikaresistenzen bei pathogenen Bakterien ist der Einsatz von Antibiotika als Wachstumsförderer jedoch begrenzt und in der EU seit 2006 verboten4; Auch in den USA ist es seit 20175 und in China seit 20206 eingeschränkt. Dennoch bleibt China der größte Produzent und Verbraucher von Antibiotika, wobei 52 % in der Tierproduktion eingesetzt werden7.

Während die gastrointestinale Mikrobiota von Schweinen eine vielfältige Population von Bakterien beherbergt, von denen bekannt ist, dass sie die Gesundheit des Wirts unterstützen, können sie auch eine Quelle für Arzneimittelresistenzgene sein. Intensivtierhaltungsbetriebe zeichnen sich durch eine Kombination aus hoher Bakterienbelastung und hohem antimikrobiellen Selektionsdruck aus: Bedingungen, die bekanntermaßen das Auftreten von antimikrobiell resistenten Bakterien (ARB) und Antibiotikaresistenzgenen (ARG) begünstigen8. Darüber hinaus können Störungen der Darmmikrobiota die ARG-Übertragung oder die Häufigkeit der vom Tier ausgeschiedenen ARB steigern.

Typischerweise wird mehr als die Hälfte der verabreichten Antibiotikadosis unverändert über Urin und Kot ausgeschieden. Nur wenige Antibiotika werden vom Wirtstier teilweise metabolisiert und ergeben mikrobiologisch aktive oder inaktive Metaboliten. Beispielsweise wird Enrofloxacin in der Leber teilweise (< 25 %) zu Ciprofloxacin metabolisiert, während Sulfonamide in geringem Maße zu den weniger aktiven N4-Acetylsulfonamiden metabolisiert werden; in beiden Fällen sind die Produkte mikrobiologisch aktiv9.

Da ein einzelnes Schwein bis zu 6,4 kg Nassmist pro Tag produzieren kann10, produzieren große Tierzuchtanlagen große Mengen an tierischem Kot, was zu einer jährlichen Produktion von 1,7 Milliarden Tonnen Kot weltweit führt11. Allein in Schweinehaltungsbetrieben in Deutschland, Spanien, Großbritannien und den Niederlanden beträgt die jährliche Gülleproduktion über 120 Millionen Tonnen12. Der einfachste und kostengünstigste Weg, solche Abfälle zu entsorgen, ist die Bodenaufbringung; Es wurde jedoch festgestellt, dass Viehmist ein Reservoir für Antibiotika, ARGs und potenziell pathogene ARB ist und eine erhebliche Gefahr für die Gesundheit von Tieren und Menschen darstellt. Tatsächlich gilt Schweinegülle als Hauptquelle für die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen in der Umwelt13,14. Es ist bekannt, dass die direkte Ausbringung von Gülle, die von mit Antibiotika behandelten Nutztieren stammt, landwirtschaftliche Flächen einer hohen Antibiotikabelastung aussetzt. Abhängig von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Antibiotikums und der Bodenzusammensetzung können die Verbindungen im mit Gülle behandelten Boden verbleiben oder durch Auswaschung oder Abfluss in das Grund- und Oberflächenwasser gelangen. Darüber hinaus können Schadstoffe vom Wasser über weite Strecken transportiert werden und das gesamte aquatische Ökosystem beeinträchtigen. Darüber hinaus variiert die Abbaugeschwindigkeit je nach Antibiotikatyp und kann in vielen Fällen bis zu 30 Tage lang sehr gering sein14. Im Boden können die Verbindungen von Nutzpflanzen aufgenommen werden, wo sie sich ansammeln und dann in die Nahrungskette gelangen. Darüber hinaus begünstigt das ständige Vorhandensein einer geringen Konzentration an Antibiotika und ihren aktiven Rückständen in der Umwelt die Selektion resistenter Bakterien14.

Die am häufigsten angewandte Strategie zur Güllebewirtschaftung ist die Lagerung, bei der der Kot einfach für längere Zeit an einem dafür vorgesehenen sicheren Ort aufbewahrt wird. Dies setzt eine ausreichende Lagerkapazität voraus, da die Mindestlagerzeit vor der Ausbringung je nach Tierart, Weidedauer und geografischer Lage zwischen 4 und 7,5 Monaten beträgt15. Alternativ kann Mist auch kompostiert werden: eine ökologisch und wirtschaftlich vorteilhafte Methode zur Verarbeitung fester organischer Abfälle, die eine effiziente Volumenreduzierung, Entfernung von Krankheitserregern und eine Reduzierung des Antibiotikagehalts ermöglicht16. Lagerung und Kompostierung gehören zu den Grundsätzen der grünen Chemie; Allerdings kann die Kompostierung von Mist berechtigte Umweltbedenken aufwerfen17,18,19. Methan entsteht bei der anaeroben Zersetzung organischer Stoffe. Unter aeroben Bedingungen wird Methan zu Kohlendioxid oxidiert, das weniger zur globalen Erwärmung beiträgt als Methan. Ein unsachgemäß durchgeführter Kompostierungsprozess kann zu erhöhten Methanemissionen führen. Der Agrarsektor trägt am meisten zur anthropogenen Methanemission bei (50,63 %), aber die Emissionen im Zusammenhang mit der Güllebewirtschaftung machen den geringsten Teil davon aus (59,84 % im Zusammenhang mit der enterischen Fermentation, gefolgt von Emissionen aus dem Reisanbau und anderen landwirtschaftlichen Praktiken und Güllemanagement) und nimmt immer noch ab (gemessen von 1990 bis 2010)20. In der vorgeschlagenen Studie haben wir uns auf Schweinemist und nicht auf Schweinegülle konzentriert. Wenn flüssiges Material (Schweinegülle) in Güllegruben oder Lagunen gelagert wird, ist die Wahrscheinlichkeit größer, dass es anaerobe Prozesse und damit eine höhere Methanproduktion entwickelt als bei Trockenmist21. Es ist jedoch schwierig, die Methanproduktion aus dem Managementsystem im Voraus zu bestimmen, sie hängt von der Zusammensetzung des Mists, den Lager-/Kompostierungsbedingungen (pH-Wert, Temperatur, Feuchtigkeit oder C/N-Gehalt), der Tierart oder sogar der Tierernährung ab20.

Derzeit liegen nur wenige Daten zur Verteilung von ARGs in festem Schweinegülle und seiner mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur vor; Darüber hinaus wurde in keiner Studie die Kompostierung und Lagerung von Material aus derselben Quelle verglichen. Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Rolle von Schweinegülle als entscheidender Hotspot für die Ausbreitung von ARGs in der Umwelt zu bewerten, auch unter Berücksichtigung der strengen Kontrolle der Antibiotikaanwendung bei Nutztieren in EU-Mitgliedsländern. Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, Kompostierung zur Behandlung von Gülle vor der Ausbringung auf dem Land und nicht vor der Lagerung einzuführen. Es bestimmt auch das Übertragungspotenzial von ARGs, indem es die Korrelationen zwischen mikrobiellen Phyla und ARG-Gruppen sowie zwischen ARG und mobilen genetischen Elementen (MGE) identifiziert, die sowohl während der Lagerung als auch bei der Kompostierung beobachtet werden. Um herauszufinden, wie die Ausbreitung von AMR am besten reduziert werden kann, bevor Gülle auf die Felder ausgebracht wird, vergleicht die Studie die Auswirkungen zweier häufig verwendeter Güllemanagementstrategien, Lagerung und Kompostierung, im Labormaßstab. Bei der Durchführung der Analysen haben wir die Art des Prozesses als unabhängige Variable und die relative Häufigkeit von ARG und die relative Häufigkeit des mikrobiellen Stammes als abhängige Variablen angenommen. Es ist wichtig zu beachten, dass alle bei den beiden Methoden verwendeten Proben von denselben Tieren aus einem einzigen Betrieb und zum selben Zeitpunkt entnommen wurden. Die Analyse besteht hauptsächlich aus Hochdurchsatz-qPCR, um die Änderungen in der ARG-Verteilung über alle Proben hinweg zu bestimmen, und Sequenzierungsprotokollen, die auf die variablen V3-V4-Regionen der 16S-rRNA abzielen, um die Identifizierung mikrobieller Gemeinschaften zu ermöglichen.

Die Schweinemistprobe wurde im Frühjahr (April) 2019 von einem polnischen kommerziellen Schweinemastbetrieb entnommen. Mist und Gülle wurden auf dem Bauernhof getrennt. Eine feste Fraktion wurde in zwei blauen Kunststofffässern von jeweils etwa 20 Litern gesammelt (eines zur Kompostierung und das andere zur Lagerung) und vor der weiteren Verarbeitung und Analyse ins Labor gebracht. Der Farmbesitzer stimmte der Probenahme von Gülle zu und teilte die Geschichte des Einsatzes von Antibiotika auf dem Farm mit. Aus Datenschutzgründen werden der genaue Standort der Farm und Angaben zum Landwirt nicht bekannt gegeben. Antibiotika wurden gemäß der EU-Gesetzgebung eingesetzt – Verordnung (EU) 2019/61 über Tierarzneimittel und Verordnung (EU) 2019/4 über Arzneifuttermittel22. Der Schweinebestand besteht aus 200 Schweinen (50 Schweine pro Gruppenstall), die Gewichtszunahme beträgt 1100 g/Tag/Schwein. Verwendete Nahrung: 80 % Getreideschrot aus eigener Landwirtschaft, 20 % Ergänzungsfuttermittel: Proteinbasis, Sojaschrot oder Rapsschrot + Vitamine, Mikro- und Makronährstoffe.

5 kg Schweinegülle wurden mit Sägemehl aus Sitka-Fichte im Verhältnis 4 (Gülle):1 (Sägemehl) (Gew./Gew.) gemischt und in einen Eimer gegeben. Sägemehl wurde im örtlichen Baumarkt bezogen. Der Gehalt an organischer Substanz, Gesamtstickstoff, Phosphor, Kalzium, Magnesium und Schwermetallen (Cr, Cu, Cd, Ni, Pb, Zn, Hg) im Rohmist und nach Lagerung (4 M) und Kompostierung (10 W) wurde bestimmt: Hg-Gehalt nach dem in DIN ISO 16772 beschriebenen Verfahren, andere Schwermetalle (ICP-OES/ICP-MS) – DIN EN ISO 11885/DIN EN ISO 17294-2, Gesamtstickstoff – VDLUFA, Bd. Ich, Kap. A 2.2.1, Ammoniakstickstoff – DIN 38406 E5-1 Mod., trockene organische Substanz – DIN EN 12879. Nur Hg und der Gehalt an trockener organischer Substanz wurden gemäß der dedizierten akkreditierten Norm bestimmt; Andere Komponenten wurden gemäß den in den Normen beschriebenen Verfahren analysiert, jedoch an unsere Bedürfnisse angepasst.

Obwohl sich die Dauer beider Prozesse unterscheidet, wurden die Kompostierungs- und Lagerzeiträume nach allgemein üblichen Praktiken angewendet – die Lagerzeit von vier Monaten wurde gemäß der EU-Gesetzgebung festgelegt, und zehn Wochen reichten aus, um die Kompostierung wie von Ros beschrieben abzuschließen et al.23. Unser Ziel war es, häufig empfohlene Strategien zur Güllebehandlung mit der empfohlenen Dauer zu vergleichen.

Der Behälter mit der Mischung wurde im Labor unter der belüfteten Haube bei Umgebungstemperatur aufgestellt. Der Kompost wurde zehn Wochen lang jede Woche umgewälzt (gut gemischt). Die Temperatur, Feuchtigkeit und der pH-Wert wurden jede Woche im Kompost bei etwa 15 cm (der halben Höhe der Mischung) gemessen. Der Feuchtigkeitsgehalt wurde regelmäßig gemessen und durch Zugabe von sterilem MilliQ-Wasser auf 50–60 % eingestellt (um eine mögliche Kontamination mit ARGs oder Bakterien zu vermeiden). Das Experiment wurde dreifach durchgeführt. Proben für die mikrobiologische und molekulare Analyse wurden zu Beginn, in der Mitte (fünfte Woche) und am Ende des Prozesses (zehnte Woche) gesammelt.

Der Behälter mit dem Material wurde im Labor unter der belüfteten Haube bei Umgebungstemperatur aufgestellt; Das Material wurde jedoch nicht gemischt. Jede Woche wurden Temperatur, Feuchtigkeit und pH-Wert im Material in etwa 15 cm (halber Höhe) gemessen. Das Experiment wurde dreifach durchgeführt. Proben für die mikrobiologische und molekulare Analyse wurden zu Beginn des Prozesses, in der Mitte (zweiter Monat) und am Ende (vierter Monat) entnommen.

Im gesamten Experiment haben wir insgesamt 200 Proben gesammelt. Wir nehmen 40 Proben pro Gruppe, die aus drei technischen Wiederholungen pro Gruppe stammen (Kontrolle, kompostierte Proben nach fünf Wochen und zehn Wochen und gelagerte Proben nach zwei Monaten und vier Monaten). Isolierte DNA aus der Gruppe wurde nach Gruppen zusammengefasst und zur Analyse geschickt.

Die Gesamt-DNA wurde aus 500 mg der Gülleprobe mit dem FastDNA™ SPIN Kit for Feces (MP Biomedicals) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Die Qualität und Quantität der extrahierten DNA wurden mit einem Invitrogen Qubit 4.0 Fluorometer (dsDNA-Hochempfindlichkeits-Assay-Kit) und einem Colibri-Spektrophotometer (Titertek Berthold) analysiert. Die DNA-Proben wurden dreifach isoliert und dann gepoolt, um für jeden Zeitpunkt eine einzige DNA-Probe zu erhalten.

Die Merkmale der Struktur der Bakteriengemeinschaft wurden durch 16S-rRNA-Sequenzierung bestimmt, die auf die variablen V3-V4-Regionen der bakteriellen 16S-rRNA abzielte. Den Empfehlungen des Herstellers folgend wurden die Bibliotheken mit Nextera® XT index Kit v2 Set A (Illumina) vorbereitet. Die vorbereiteten Amplikons wurden dann einer Hochdurchsatzsequenzierung unter Verwendung der MiSeq Illumina-Plattform unterzogen, um 2 × 300 bp Paired-End-Sequenzen in der DNA Sequencing and Oligonucleotid Synthesis Facility (Institut für Biochemie und Biophysik der Polnischen Akademie der Wissenschaften) zu erzeugen. Rohsequenzen wurden mit der Qiime2-Software24 mit der DADA2-Option zur Sequenzqualitätskontrolle und der neuesten Version der ribosomalen RNA-Sequenzdatenbank SILVA für die Taxonomiezuordnung25,26 verarbeitet und analysiert. Die erhaltenen Daten wurden mit MicrobiomeAnalyst27 analysiert und visualisiert.

Das qPCR-Array wurde im SmartChip Real-time PCR-System von Resistomap (Finnland) durchgeführt. Die qPCR-Zyklusbedingungen und die anfängliche Datenverarbeitung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt28. Für jede DNA-Probe wurde die gleiche 384-Well-Primer-Matrize verwendet. Für jede Probe wurden drei technische Replikate durchgeführt. Die für die Analyse verwendeten Proben haben eine ähnliche Qualität: 260/280-Verhältnis von 1,8–2,0 (+/−0,1) und eine Konzentration von 10 ng/μl. Die Konzentration der Probe wurde mit dem Qubit 4.0 Fluorimeter (Thermo Fisher Scientific) und die Qualität mit einem Colibri-Spektrophotometer (Titertek Berthold) gemessen. Es wurden nur Proben analysiert, die den beschriebenen Kriterien entsprachen. Nach der Amplifikation auf Basis des qPCR SmartChip Real-Time PCR Cycler (Takara) wurden die Schwellenwertzykluswerte (CT) unter Verwendung von Standardparametern berechnet, die mit der SmartChip-Analysesoftware bereitgestellt wurden; Die Gene und Primersequenzen sind in der Ergänzungsdatei 4 aufgeführt. Die in Blatt 1 der Ergänzungsdatei 4 aufgeführten und kategorisierten Gennamen und -gruppen werden im gesamten Manuskript verwendet.

Für alle Proben wurden für jeden Primersatz eine Schmelzkurven- und qPCR-Effizienzanalyse durchgeführt. Amplikons mit unspezifischen Schmelzkurven und mehreren Steigungsprofilpeaks wurden als falsch positiv betrachtet und aus der Analyse verworfen. Für die weitere Analyse wurden Proben entnommen, die die folgenden Kriterien erfüllten: (1) Ct-Werte ≤ 27, (2) mindestens zwei Replikate, (3) Amplifikationseffizienz im Bereich von 1,8 bis 2,2. Die relative Kopienzahl wurde mit Gleichung berechnet. (1)29. Die Genkopienzahlen wurden durch Normalisieren der relativen Kopienzahlen pro 16S-rRNA-Genkopienzahlen berechnet.

Die minimale Stichprobengröße wurde mit der G*Power-Software (Version 3.1.9.7)30,31 berechnet.

Daten aus der metagenomischen Sequenzierung, die auf V3-V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens und Hochdurchsatz-qPCR abzielt, wurden in Excel-Dateien (Microsoft Office 2019) gesammelt und sind in XLSX-Dateien als ergänzende Materialien angehängt. Die Berechnung der ARG-Prävalenz erfolgte in Excel gemäß Gl. (1).

Die Ergebnisse der Sequenzierung der Bakteriengemeinschaft und der Prävalenz antibakterieller Resistenzgengruppen wurden mit dem MicrobiomeAnalyst 2.0-Webserver27 analysiert und visualisiert. Zur Bestimmung des Reichtums und der Diversität der Bakteriengemeinschaft wurden Shannon- und Chao1-Indizes verwendet. Die Unterschiede zwischen den oben genannten Parametern wurden mithilfe von Kruskal-Wallis-Einweg-Varianzanalysen nichtparametrischer Tests bestimmt. Die Hauptkoordinatenanalyse wurde unter Verwendung des Bray-Curtis-Unähnlichkeitsindex durchgeführt. Alle Tools wurden vom MicrobiomeAnalyst-Tool bereitgestellt. Die Parameter unterscheiden sich erheblich, wenn p < 0,05.

Die Beziehungen zwischen ARG und MGEs sowie zwischen ARG und mikrobiellen Taxa wurden mithilfe des nichtparametrischen Korrelationskoeffizienten nach Spearman bestimmt. Die Berechnung des Korrelationskoeffizienten nach Spearman und die Datenvisualisierung wurden mit GraphPad Prism 9 (Graph Pad Prism Version 9.0.0) durchgeführt. Die analysierten Beziehungen wurden zum Aufbau von Netzwerken mit Cytoscape (Cytoscape Version 3.9.0) verwendet. Die Korrelationen wurden als stark und signifikant angesehen, wenn der absolute Wert des Spearman-Ranges |r|> 0,7 und p < 0,0532 war.

Es wurde festgestellt, dass der Gehalt an organischer Substanz (OM) nach der Lagerung statisch war, nach der Kompostierung wurde jedoch ein leichter Anstieg beobachtet. Darüber hinaus zeigten beide Gruppen der behandelten Substanz eine Anreicherung von N, aber eine Verringerung der Konzentration von P, Mg und Ca im Vergleich zum Ausgangswert. Es wurde festgestellt, dass der pH-Wert der Gülle während der Kompostierung leicht von 7,0 auf 7,4 anstieg; ein ähnlicher Anstieg wurde jedoch während der Lagerung beobachtet. Während des Prozesses wurden Luftfeuchtigkeit, pH-Wert und Temperatur zehn Wochen lang wöchentlich gemessen. Die Konzentrationen von Schwermetallen blieben unter den geltenden Standards in der EU, die als sicher gelten. Alle Ergebnisse sind in den Tabellen S1 und S2 (Ergänzungsdatei 1) dargestellt.

Die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften auf Phylum-Ebene wird anhand des Diagrammtyps „Relative Häufigkeit“ dargestellt (Abb. 1). Die Daten liegen als Zusatzdatei 2 vor.

Mikrobielle Zusammensetzung von Proben auf Stammebene. Die Proben wurden in drei Gruppen eingeteilt – Kontrolle (PM roh; Probe vor der Behandlung), kompostiert (PM-Kompostierung 5 W, PM-Kompostierung 10 W; kompostierte Proben nach fünf bzw. zehn Wochen) und gelagert (PM gelagert 2 M, PM gelagert). 4 M; gelagerte Proben nach zwei bzw. vier Monaten); Gestapelte Balkendiagramme stellen den Durchschnittswert für drei Replikate dar.

Die relative Häufigkeit von Bacterioidetes verringerte sich nach fünf Wochen (18,8 %) und stieg dann nach zehn Wochen (43,6 %) während der Kompostierung an; Allerdings sank dieser Wert nach zwei Monaten (14,7 %) und stieg dann nach vier Monaten (51,3 %) während der Lagerung an. Die relative Häufigkeit von Firmicutes nahm während der Kompostierung nach fünf Wochen zu (30,2 %) und nahm nach zehn Wochen ab (21,7 %), nahm aber während der Lagerung kontinuierlich zu (28,5 % bzw. 52,8 nach zwei bzw. vier Monaten). Die relative Häufigkeit von Proteobakterien nahm sowohl während der Kompostierung (13,8 % nach fünf Wochen und 28,8 % nach zehn Wochen) als auch während der Lagerung (28,2 % nach zwei Monaten und 55,5 % nach vier Monaten) zu. Schließlich stieg die Prävalenz von Actinobakterien zunächst an (10,6 %), nahm jedoch später in den letzten Stadien der Kompostierung ab (3 %); Allerdings stieg sein Wert während der Lagerung kontinuierlich von 16,4 % nach zwei Monaten auf 21,8 % nach vier Monaten.

Der Reichtum und die Vielfalt der mikrobiellen Gemeinschaften wurden anhand der Shannon- und Chao1-Indizes analysiert (Abb. 2). Der Shannon-Index zeigte während der Lagerung und Kompostierung niedrigere Werte als die unbehandelten Kontrollproben, jedoch nur als Trend. Auch der Chao1-Index zeigte während der Lagerung und Kompostierung niedrigere Werte als die unbehandelten Kontrollproben auf Trendniveau. Eine Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen allen Proben basierend auf dem Bray-Curtis-Unähnlichkeitsindex zu bestimmen; Das PCoA-Diagramm zeigte keine Unterschiede zwischen den Proben je nach Bewirtschaftungsstrategie (einschließlich unbehandelter Gülle).

(A) Shannon-Indizes für die Vielfalt mikrobieller Gemeinschaften (p-Wert 0,07 [Kruskal-Wallis]); (B) Chao-1-Indizes für den Reichtum mikrobieller Gemeinschaften (p-Wert 0,1 [Kruskal-Wallis]); Die Proben wurden in drei Gruppen eingeteilt – Kontrolle (PM roh 1, PM roh 2, PM roh 3; Proben vor der Behandlung), kompostiert (PM-Kompostierung 5 W, PM-Kompostierung 10 W; kompostierte Proben nach fünf bzw. zehn Wochen) und gelagert (PM gelagert 2 M, PM gelagert 4 M; gelagerte Proben nach zwei bzw. vier Monaten).

Obwohl sich die Shannon- und Chao1-Indizes nicht wesentlich unterscheiden, variierte die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen behandeltem und rohem Schweinemist. Viele Bakterienstämme nehmen während der Kompostierung und Lagerung ab, es tritt jedoch keine auf (Ergänzungsdatei 3).

Die relative Häufigkeit der analysierten Genklassen und MGEs variierte während der Kompostierung und Lagerung (Abb. 3) (Rohdaten sind als Ergänzungsdatei 4 verfügbar). In beiden Fällen wurde in behandeltem Mist eine höhere Gesamthäufigkeit nachgewiesener Gene beobachtet als in unbehandeltem Mist; Es wurde jedoch festgestellt, dass die Verteilung der einzelnen ARGs und ARG-Gruppen je nach Behandlungsart unterschiedlich ist. Die Veränderungen beim Vorhandensein einzelner Gene werden durch eine Heatmap visualisiert (Ergänzungsdatei 5). Im Rohmist waren die meisten nachgewiesenen Gene mit der Tetracyclin-Resistenz verbunden, gefolgt von der Aminoglykosid-, MLSB- und Sulfonamid-Resistenz. Die niedrigsten Häufigkeiten wurden für Phenicol-, Vancomycin- und Trimethoprim-Resistenzgene festgestellt.

Relative Häufigkeit erkannter antimikrobieller Resistenzgene und Genklassen mobiler genetischer Elemente, die während der qPCR-Analyse erkannt wurden. Die Proben wurden in drei Gruppen eingeteilt – Kontrolle (PM roh; Probe vor der Behandlung), kompostiert (PM-Kompostierung 5 W, PM-Kompostierung 10 W; kompostierte Proben nach fünf bzw. zehn Wochen) und gelagert (PM gelagert 2 M, PM gelagert 4). M; gelagerte Proben nach zwei bzw. vier Monaten); Gestapelte Balkendiagramme stellen den Durchschnittswert für drei Replikate dar.

Die Kompostierung führt zu einem vorübergehenden Anstieg der Gesamtmenge der nachgewiesenen Gene auf 1,23 Genkopien/16S-rRNA-Genkopien nach fünf Wochen, gefolgt von einem Rückgang auf 0,77 Genkopien/16S-rRNA-Genkopien nach zehn Wochen. Der Kompostierungsprozess führte zu einem Rückgang der Gesamtzahl der Tetracyclin-Resistenzgene; Dies führte auch zu einem Rückgang der Anzahl der MLSB-, Beta-Lactam-, Phenicol- und Vancomycin-Resistenzgene sowie der Gene, von denen bekannt ist, dass sie Resistenzen gegen andere antimikrobielle Mittel bieten. Die Kompostierung führte auch zu einer Verringerung der relativen Mengen an Genen, die für die Multiresistenz (MDR) verantwortlich sind, sowie der relativen Häufigkeit von Genen, die als Integrone klassifiziert wurden. Der Prozess führte jedoch zu einem Anstieg der Gesamtmengen an Aminoglycosid-Resistenzgenen und Sulfonamid-Resistenzgenen sowie der Menge an MGEs.

Im Gegensatz dazu stieg die relative Häufigkeit der Gene während der Lagerung nach zwei Monaten auf 1,31 Genkopien/16S-rRNA-Genkopien und nahm dann nach vier Monaten ab (1,29 Genkopien/16S-rRNA-Genkopien). Der Lagerungsprozess führte zu einem Rückgang der Tetracyclin-, MLSB-, Beta-Lactam- und Vancomycin-Resistenzgene, und viele Aminoglycosid-, Sulfonamid-, Phenicol- und Trimethoprim-Resistenzgene wurden nach viermonatiger Behandlung nachgewiesen. Die Lagerung führte auch zu einem Anstieg der Anzahl von Resistenzgenen gegen andere antimikrobielle Mittel, Integrone und MGEs. Bei beiden Prozessen blieb die Anzahl der nachgewiesenen Gene im Vergleich zum anfänglichen Niveau von 0,79/16S-rRNA-Genkopien erhöht. Bei der Kompostierung erreichten jedoch alle Gene nach Woche 10 ihren niedrigsten Wert.

Während festgestellt wurde, dass die relative Häufigkeit von ARGs im Allgemeinen bei beiden Behandlungsstrategien zunahm, variierte diese Tendenz je nach Genklasse (Tabelle S3, Ergänzungsdatei 1). Die relative Häufigkeit von Beta-Lactam-, Tetracyclin- und Vancomycin-Resistenzgenen, Genen, die den MLSB-Resistenz-Phänotyp verleihen, und Genen, die den MDR-Phänotyp kodieren, war am Ende der Kompostierung und am Ende der Lagerung verringert. Interessanterweise nahm die relative Häufigkeit der Integrone während der Kompostierung ab, während ihre Kopienzahl während der Lagerung zunahm. Eine ähnliche Situation wurde bei Phenicol-Resistenzgenen beobachtet: Ihre Häufigkeit nahm nach der Kompostierung ab, nahm aber nach viermonatiger Lagerung zu. Darüber hinaus nahmen die als „Sonstige“ klassifizierten Resistenzgene nach der Kompostierung ab und stiegen nach der Lagerung an. Die Anzahl der Kopien der verbleibenden analysierten ARG-Gruppen stieg während beider Strategien zur Güllebewirtschaftung, das Ausmaß der Veränderung variierte jedoch je nach Prozess.

Die PCoA der relativen Häufigkeiten von ARGs und MGEs in allen Probengruppen, berechnet auf der Grundlage der Bray-Curtis-Distanzmethode, ergab eine signifikante visuelle Trennung zwischen den anfänglichen (unbehandelten) und behandelten Proben im Hinblick auf die relativen Häufigkeiten resistenter Genklassen (p < 0,05) (Abb. 4).

Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) der relativen Häufigkeit von ARG und MGE in allen Probengruppen basierend auf der Bray-Curtis-Distanzmethode. Es wurde die statistische Methode ANOSIM verwendet. [ANOSIM] R: 0,98401; p-Wert < 0,001. Die Proben wurden in drei Gruppen eingeteilt – Kontrolle (PM roh 1, PM roh 2; Proben vor der Behandlung), kompostiert (PM-Kompostierung 5 W, PM-Kompostierung 10 W; kompostierte Proben nach fünf bzw. zehn Wochen) und gelagert (PM gelagert 2). M, PM lagerte 4 M; gelagerte Proben nach zwei bzw. vier Monaten).

Das am häufigsten vorkommende Gen in rohem Schweinemist war aadE, gefolgt von tetM_1. Beide Gene wurden sowohl bei der Kompostierung als auch bei der Lagerung wirksam reduziert. Von den zehn häufigsten Genen in rohem Schweinemist (aadE, tetM_1, tetM_3, tetPB_3, tnpA_2, qacEΔ1_2, tetQ, sul2_2, tetW, tetM_2 – von hoch nach niedrig eingestuft) stiegen zwei nach der Behandlung an: tnpA_2 und qacEΔ1_2. Erstere gehört zur IS21-Gruppe der Transposasen und wurde im Rahmen dieser Studie der MGE-Gruppe zugeordnet, während letztere Effluxpumpen kodiert, einen der für MDR verantwortlichen Mechanismen. Sowohl die Kompostierung als auch die Lagerung führten zu einer Verringerung der Häufigkeit von 80 % der im Rohmist nachgewiesenen Gene; Davon ist eines ein Aminoglycosid-Resistenzgen, sechs sind Tetracyclin-Resistenzgene, eines war ein MGE, eines ein MDR-Mechanismus und eines ein Sulfonamid-Resistenzgen. Das Kernresistom der analysierten Proben ist in Abb. 5 dargestellt.

Kernresistom in Schweinegülleproben. Das Venn-Diagramm, das die Anzahl der erkannten Gene in allen Proben und deren Schnittmenge darstellt, wurde von InteractiVenn33 erstellt. Die Proben wurden in drei Gruppen eingeteilt: PM roh – unbehandelter Schweinemist, PM-Kompost 10 W – Schweinemist nach 10 Wochen Kompostierung, PM Lagerung 4 M – Schweinemist nach vier Monaten Lagerung.

Es wurde festgestellt, dass die angewandten Strategien zur Güllebewirtschaftung die ARG-Vielfalt nur teilweise verringern (Tabelle S4, Zusatzdatei 1). Während der viermonatigen Lagerung nahm die Zahl der Integrone zu, während der Kompostierung nahm sie jedoch ab. Die Anzahl der Trimethoprim-Resistenzgene wurde bei keinem der Verfahren verringert. Die Anzahl der Aminoglycosid-, Beta-Lactam-, Phenicol-, Sulfonamid-, Tetracyclin- und Vancomycin-Resistenzgene, Gene, die den MLSB-Resistenz-Phänotyp kodieren, Gene, die den MDR-Phänotyp verleihen, MGEs und Resistenzgene gegen andere antimikrobielle Mittel waren verringert.

Um die Beziehung zwischen 157 ARGs und 21 MGEs (einschließlich Integrons) während der Kompostierung zu bestimmen, wurde ein Kookkurrenznetzwerk aufgebaut. Dieses Netzwerk (Abb. 6) enthält insgesamt 179 Knoten und wurde auf der Grundlage von 959 starken (|r|> 0,9) und signifikanten Korrelationen (p ≤ 0,05) mit 942 positiven und 17 negativen Korrelationen erstellt. Die MGEs zeigten mehr Verbindungen als ARGs, was auf eine wichtigere Rolle bei der Netzwerkbildung hinweist. Unter der MGEs- und Integronengruppe zeigten orf39-IS26, IncN_rep, IncQ_oriT, orf37-IS26, IS1111, tnpA_4 und IncW_trwAB die höchste Anzahl an Korrelationen mit ARGs. Die restlichen Ergebnisse sind in Abb. 6 dargestellt.

ARG- und MGE-Interaktionsnetzwerk im Kompost. Das Netzwerk wird als „organisches Layout“ dargestellt. Es zeigt sich eine starke und signifikante Korrelation, die auf der Rangkorrelation nach Spearman basiert, wobei |r|> 0,9 und p < 0,05 ist. Die Größe der Knoten stellt den Grad der Interaktion dar. Die grauen und orangefarbenen Kanten zeigen positive bzw. negative Korrelationen zwischen ARGs und MGEs. Die Farbe der Knoten gab der Legende zufolge den ARG-Typ an.

Die Beziehung zwischen 155 ARGs und 19 MGEs (zusammen mit Integronen) während der Speicherung wurde durch den Aufbau eines Koexistenznetzwerks bestimmt. Die Analyse umfasste 155 ARGs und 19 MGEs, die im gesamten Speicherprozess bewertet wurden. Dieses Netzwerk (Abb. 7) enthielt insgesamt 152 Knoten und wurde auf der Grundlage von 1224 starken (|r|> 0,9) und signifikanten Korrelationen (p ≤ 0,05) mit 1211 positiven und 13 negativen Korrelationen erstellt. Die MGEs zeigten mehr Verbindungen als ARGs, was darauf hindeutet, dass sie eine wichtige Rolle bei der Netzwerkbildung spielen. In der MGE- und Integrongruppe sind orf39-IS26, IncN_rep, IncQ_oriT, orf37-IS26, IS1111, tnpA_4, IncW_trwAB, tnpA_5 tnpA_7, intI1_3, IS613, intI1_4, intI1_1, repA, tnpA_1, IS1247_2, tnpA_2, intI2_2, zeigte die höchste Zahl von Korrelationen mit ARGs. Die restlichen Ergebnisse sind in Abb. 7 dargestellt.

ARG- und MGE-Interaktionsnetzwerk im Kompost. Das Netzwerk wird als „organisches Layout“ dargestellt. Eine starke und signifikante Korrelation zeigt sich anhand der Rangkorrelation nach Spearman, wobei |r|> 0,9 und p < 0,05 ist. Die Größe der Knoten stellt den Grad der Interaktion dar. Die grauen und blauen Ränder zeigen positive bzw. negative Korrelationen zwischen ARGs und MGEs. Die Farbe der Knoten gibt laut Legende den ARG-Typ an.

Die Wechselwirkungen zwischen 26 Phyla und 12 Genklassen (10 ARGs-Klassen, Integrons und MGEs), die während des Kompostierungsverfahrens identifiziert wurden, wurden untersucht. Das resultierende Kookkurrenznetzwerk (Abb. 8) enthielt 37 Knoten und wurde auf der Grundlage von 79 starken (|r|> 0,85) und signifikanten (p ≤ 0,05) Korrelationen mit 54 positiven und 25 negativen Korrelationen erstellt. Wie im Netzwerk gezeigt, zeigten die Genklassen mehr Interaktionen als die mikrobiellen Phyla, was darauf hindeutet, dass diese Gene eine entscheidende Rolle beim Aufbau des Koexistenznetzwerks spielen. Während die Gene, die den MDR-Mechanismus kodieren, die höchste Interaktion mit mikrobiellen Phyla zeigten, zeigten Gene, die die Resistenz gegen Aminoglykoside und Trimethoprim kodieren, sowie Gene, die der Klasse „Andere“ zugeordnet wurden, ebenfalls ein hohes Maß an Interaktion. Das geringste Maß an Verbindungen wurde für Integrons und MGEs beobachtet. Die restlichen Ergebnisse sind in Abb. 8 dargestellt.

Analyse des Interaktionsnetzwerks mikrobieller Taxa und Genklassen während der Kompostierung, dargestellt als „zirkuläres Layout“, basierend auf dem gleichzeitigen Vorkommen von ARG-Gruppen und mikrobiellen Phyla. Ein Zusammenhang besteht signifikant mit Spearmans |r|> 0,85 und p < 0,05. Die grauen und orangefarbenen Ränder stellen die positiven bzw. negativen Korrelationen zwischen ARG-Gruppen und Phyla dar. Die Größe der Knoten zeigt den Grad der Interaktion. Grüne Knoten repräsentieren mikrobielle Phyla und blaue Knoten repräsentieren Gruppen von ARGs.

Die Wechselwirkungen zwischen 26 Phyla und 12 Genklassen (10 ARG-Klassen, Integrons und MGEs), die während der Lagerung von Schweinegülle identifiziert wurden, wurden untersucht. Das konstruierte Kookkurrenznetzwerk (Abb. 9) enthielt 34 Knoten und wurde auf der Grundlage von 58 starken (|r|> 0,85) und signifikanten (p ≤ 0,05) Korrelationen erstellt: 40 positive und 18 negative Korrelationen. Abgesehen von Planctomycetes zeigten alle Bakterienstämme entweder negative oder positive Korrelationen mit den untersuchten Genklassen. Von den Stämmen zeigten die Planctomyceten die meisten Korrelationen, nämlich drei positive (MDR-, MLSB- und Tetracyclin-Resistenzgene) und vier negative (MGE, Integrone, als andere klassifizierte Gene und Phenicol-Resistenzgene). Die restlichen Ergebnisse sind in Abb. 9 dargestellt.

Analyse des Interaktionsnetzwerks mikrobieller Taxa und Genklassen während der Lagerung, dargestellt als „zirkuläres Layout“, basierend auf dem gleichzeitigen Vorkommen von ARG-Gruppen und mikrobiellem Stamm. Ein Zusammenhang ist signifikant korreliert, wenn Spearmans |r|> 0,85 und p < 0,05. Die grauen und orangefarbenen Ränder stellen die positiven bzw. negativen Korrelationen zwischen ARG-Gruppen und Phyla dar. Die Größe der Knoten zeigt den Grad der Interaktion. Grüne Knoten repräsentieren mikrobielle Phyla und blaue Knoten repräsentieren Gruppen von ARGs.

Das langfristige Ziel der Güllebewirtschaftung besteht darin, Umweltschadstoffe zu entfernen: die große Abfallmenge zu entsorgen, ihren Wert zur Verbesserung der Bodenfruchtbarkeit zu nutzen und die Biosicherheit zu gewährleisten. Daher war es notwendig, die physikalisch-chemischen Eigenschaften von behandeltem und unbehandeltem Mist zu untersuchen.

Kompostierter Schweinegülle hat einen alkalischen pH-Wert, der dazu beiträgt, den pH-Wert des Bodens aufrechtzuerhalten oder zu erhöhen; Dies ist von großer Bedeutung für die Aufrechterhaltung des richtigen Stickstoffkreislaufs und der Phosphorverfügbarkeit sowie für die Erhöhung der Aufnahme von Mikronährstoffen durch Pflanzen34,35. Die Verwendung von kompostiertem Mist zur Erhöhung der organischen Substanz des Bodens hat eine agronomische Berechtigung und steht auch im Einklang mit dem EU-Aktionsplan für die Kreislaufwirtschaft36: Er verbessert die physikalischen (Bodenstruktur) und physikalisch-chemischen Bedingungen des Bodens durch die Erhöhung seiner Sorptionseigenschaften (die Rolle des Humus). ) und Gehalt an organischen Substanzen; Dies stimuliert das Bodenmikrobiom, was wiederum eine weitere Kette von Veränderungen auslöst, die den Pflanzen zugute kommen37.

Um die Ausbreitung von ARGs und potenziell pathogenen Mikroorganismen aus tierischen Fäkalien auf Ackerflächen und dann auf Nutzpflanzen zu stoppen, wurden verschiedene Strategien zur Vorbehandlung von Gülle untersucht. Ein wichtiges Ziel in diesem Zusammenhang besteht darin, Praktiken zu identifizieren, die ihre Konzentrationen verringern können, anstatt sie einfach zu verdünnen38. Die Häufigkeit von ARGs im Nutztiermist nach der Kompostierung ist sehr unterschiedlich. Dies hängt von mehreren wesentlichen Faktoren ab, darunter der Reproduktions- und Absterberate der ARG-tragenden Darmmikroorganismen, dem Druck, der durch Antibiotikarückstände und Schwermetalle auf sie ausgeübt wird, der die Persistenz von Resistenzgenen in der Bakteriengemeinschaft begünstigt, und der Möglichkeit eines horizontalen Gentransfers zwischen Bakterien39.

Bei der Quantifizierung des Antibiotika-Resistoms ist es wichtig zu berücksichtigen, dass Veränderungen in der Häufigkeit von Resistenzgenen einfach auf Veränderungen in der zugrunde liegenden mikrobiellen Struktur zurückzuführen sein können, da die Zusammensetzung der Gemeinschaft auch die Zusammensetzung von Resistenzgenen beeinflussen kann40. In der vorliegenden Studie erfuhr die Bakteriengemeinschaft während der Kompostierung und Lagerung Veränderungen; Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Vielfalt oder Vielfalt der Bakteriengemeinschaften festgestellt, sondern nur allgemeine Trends in der Diversität und Vielfalt der Mikrobengemeinschaften. Die in allen Proben am häufigsten beobachteten Phyla waren Firmicutes, Bacteroidetes und Proteobacteria. Es wurde festgestellt, dass diese drei Stämme im Darmmikrobiom von Schweinen am häufigsten vorkommen41. In beiden Fällen wurde beobachtet, dass Bacteroidetes im Rohmist dominierte, wobei seine Zahl in der Mitte der Behandlung abnahm und dann gegen Ende anstieg; Während die Kompostierung jedoch dazu führte, dass der Endgehalt höher war als der Anfangswert, wurde dieser durch die Lagerung lediglich auf den Anfangswert zurückgeführt. Bei Proteobakterien und Aktinobakterien stiegen die Zahlen in der Mitte beider Prozesse; Allerdings ging die Zahl der Actinobakterien am Ende der Kompostierung zurück. Firmicutes hat eine hohe Toleranz gegenüber hohen Temperaturen und kommt daher während der thermophilen Phase häufiger vor, während Bacteroidetes niedrigere Temperaturen bevorzugt und während der Abkühlphase häufiger vorkommt42. Ähnliche Ergebnisse wurden von Do et al.43 erzielt, jedoch in flüssiger Schweinegülle und nicht in festem Mist; andere Forscher haben diese Beobachtungen jedoch auch für festen Schweinemist bestätigt44,45,46. Obwohl die Lagerung die am häufigsten angewandte Technologie zur Güllebewirtschaftung ist, haben nur wenige Studien ihre Auswirkungen auf die Bakteriengemeinschaft untersucht. Es wurde festgestellt, dass Firmicutes, Actinobacteria und Bacteroidetes die am häufigsten vorkommenden Bakterienstämme in Schweinegülle während der Lagerung unter verschiedenen Bedingungen sind47, was mit unseren vorliegenden Erkenntnissen übereinstimmt. Do et al.43 berichten auch, dass diese Phyla zu unterschiedlichen Zeitpunkten in gelagertem Mist dominieren.

Die Netzwerkanalyse von Bakterienstämmen und ARG-Gruppen im kompostierten Mist ergab, dass Proteobakterien zusammen mit Sulfonamid-Resistenzgenen, Actinobakterien mit Aminoglykosid-Resistenzgenen, Bacteroidetes mit MGEs und Firmicutes mit Integronen vorkommen. Unsere Ergebnisse stimmen teilweise mit denen einer Kookkurrenzanalyse von Liu et al. überein. al.42, die herausfanden, dass alle Bakterienstämme (Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes und Actinobacteria), die während der Kompostierung vorherrschten, stark mit Tetracyclin-Resistenzgenen, Chinolon-Resistenzgenen und Sulfonamid-Resistenzgenen assoziiert sind. Darüber hinaus fanden Song et al.48 auch heraus, dass diese Phyla mit Makrolidresistenzgenen assoziiert sind. Eine ähnliche Analyse, die an Gülleproben während der Lagerung durchgeführt wurde, ergab, dass Actinobakterien, Firmicutes und Proteobakterien mit Trimethoprim-Resistenzgenen und Aminoglykosid-Resistenzgenen assoziiert sind. Diese werden jedoch nur auf der Grundlage der Spearman-Korrelationen berechnet und müssen durch Experimente bewertet werden: Andere Forschungsteams legen möglicherweise andere Parameter oder Grenzwerte fest.

Obwohl die Kompostierung bei der Entfernung von Antibiotika effizient ist (ungefähr 64,7 % der nachweisbaren Veterinärantibiotika wurden bei der Kompostierung effizient aus der Gülle entfernt),49 sind die Situationen bei der Entfernung von ARG komplizierter. Unsere Studie stellte nach allen angewandten Güllebehandlungsstrategien eine erhöhte ARG- und MGE-Häufigkeit fest; Der geringste Anstieg wurde jedoch bei Proben beobachtet, die nach 10-wöchiger Kompostierung entnommen wurden. Ähnliche Erhöhungen der Resistenzgenprävalenz wurden zuvor von Cao et al.50 und kürzlich von Do et al.43 festgestellt. Darüber hinaus unterschied sich im PCoA-Diagramm der ARGs der Cluster, der den anfänglichen unbehandelten Proben zugeordnet wurde, deutlich von den Clustern, die behandeltem Mist zugeordnet wurden; Allerdings überschneiden sich die beiden Cluster, die zu gelagerten und kompostierten Proben gehören. Dennoch ist die Effizienz der ARG- und MGE-Entfernung nicht immer zufriedenstellend: Einige Studien berichten von einem Anstieg ihrer relativen Häufigkeit, während andere von einem Rückgang berichten51. Eine Studie zur Kompostierung von Schweinemist ergab folgende Entfernungsraten für Gene, aufgeteilt nach Antibiotikagruppen13: Beta-Lactam 36,8–73,7 %, FCA 11,8–52,9 %, MLSB 0–47,6 %, Tetracyclin 4,5–36,4 %, Vancomycin 0–71,4 %, Aminoglykosid 0–26,9 % und Sulfonamid 0 %. In unserer vorliegenden Studie führte die Kompostierung zu einer Reduzierung von Beta-Lactam- (100 %), Vancomycin- (100 %), MLSB- (86,36 %), Phenicol- (83,33 %), Aminoglycosid- (79,31 %) und anderen (71,43 %). %), Tetracyclin- (65,52 %) und Sulfonamid-Resistenzgene (40 %), wobei bei Trimethoprim-Resistenzgenen keine Verringerung beobachtet wurde. Diese Ergebnisse stimmen nur teilweise mit unseren überein. Obwohl wir, wie bereits berichtet43, einen Anstieg der MGE-Häufigkeit feststellten, war dieser Anstieg nach der Kompostierung geringer als nach der Lagerung.

In der vorliegenden Studie wurde auch das Kernresistom identifiziert, das die Resistenzgene bestimmt, die durch keine angewandte Behandlung entfernt werden. Diese Gene weisen eine Resistenz gegen Tetracycline (tet36, tetA, tetQ, tetG, tetW, tetX, tetT, tetL, tetM), Aminoglykoside (aadA5, aadA1, strB, aadA2, aadA9), Sulfonamide (sul1, sul2) und Trimethoprim (dfrA1) auf. , Florfenicol (floR), Antibiotika aus der MLSB-Gruppe (lnuB, mefA), Schwermetalle (merA) sowie MGEs (IntI1, intI2, tnpA, tnpA, IS1247) und Gene, die den MDR-Phänotyp kodieren (qacEdelta1). Alle aufgeführten Gene weisen eine Resistenz gegen Antibiotikagruppen auf, die häufig sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Medizin eingesetzt werden52.

Es ist bekannt, dass die korrekte Entwicklung der Kompostierung von ihrer aktiven und Aushärtungsphase abhängt. Pezzola et al.53 zeigten, dass die maximal erreichbare Temperatur, die Zeit bis zum Erreichen dieser Temperatur sowie der pH-Wert und die Feuchtigkeit von der verwendeten Abfallart und den Füllstoffen abhängen. Darüber hinaus scheint die Dynamik der Entfernung von Antibiotika stark von der Wahl des Füllstoffs (Sägemehl, Reishülsen, Pilzrückstände) beeinflusst zu werden49.

Obwohl diese Studien zu dem Schluss kommen, dass die Kompostierungsbedingungen die Dynamik der Antibiotika- und ARG-Eliminierung aus Gülle beeinflussen; Keine Studie hat versucht, den Prozess zu optimieren. Studien haben ergeben, dass Behandlungszeit und -temperatur die Schlüsselfaktoren sind, die sich auf Veränderungen des ARG-Gehalts während der Schlammbehandlung auswirken54,55.

Studien zu den Faktoren, die ARG-Profile während der Kompostierung bestimmen, haben ergeben, dass bestimmte physikalisch-chemische Parameter, z. B. Temperatur, pH-Wert, Ammoniakgehalt und Feuchtigkeit, einen stärkeren Einfluss auf ARGs haben als die Anwesenheit von Wirtsbakterien56,57,58. Während es sich bei der Kompostierung um einen dynamischen Prozess handelt, der durch die gemeinsame Aktivität verschiedener Bakterien, Aktinobakterien und Pilze beeinflusst wird, wird die Dynamik der Bakterienpopulation direkt von den Umgebungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert oder Feuchtigkeit beeinflusst; Wenn beispielsweise eine thermophile Bakterienart die ARGs trägt, kann ihre Häufigkeit während der thermischen Phase zunehmen59.

Der horizontale Gentransfer zwischen verschiedenen Arten wurde als gemeinsamer und bedeutender evolutionärer Prozess erkannt60. Dies zeigt sich am deutlichsten in der engen Verbindung zwischen dem Resistom der im Kot lebenden Darmbakterien und potenziellen Krankheitserregern unter ständigem Selektionsdruck der im Kot vorhandenen antimikrobiellen Substanzen. Die Hauptgefäße des Genflusses in mikrobiellen Gemeinschaften sind Plasmide, die unterschiedliche genetische Pools verbinden61. Unsere vorliegenden Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein von Plasmiden mit einem breiten Wirtsspektrum sowohl in Rohmistproben als auch in durch Kompostierung oder Lagerung behandeltem Mist hin. Plasmide mit breitem Wirtsbereich können ihre Gennutzlasten in taxonomisch weit entfernten Arten replizieren und stabil aufrechterhalten.

Unsere Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein von Plasmiden aus den Inkompatibilitätsgruppen Q, P, N und W (IncQ, IncP, IncN und IncW) hin. IncP-Plasmide können zwischen nahezu allen Arten der Alpha-, Beta- und Gammaproteobakterien übertragen und sich in ihnen replizieren. IncQ-Plasmide sind Plasmide mit breitem Wirtsspektrum, die sich in fast allen gramnegativen Bakterien vermehren können. Darüber hinaus können IncW- und IncN-Plasmide in gramnegativen Bakterien übertragen und repliziert werden62. Das Vorhandensein mobiler Plasmide mit breitem Wirtsspektrum spielt eine Schlüsselrolle bei der Verbreitung nützlicher genetischer Merkmale, einschließlich der Resistenz gegen Antibiotika, Metalle, quartäre Ammoniumverbindungen und Triphenylmethanfarbstoffe sowie den Abbau von Herbiziden, sowohl innerhalb als auch außerhalb der Population einer bestimmten Art it14,62.

Unsere Studie identifizierte auch IncP_oriT und IncQ_oriT; oriT ist der Replikationsursprung in Transfersystemen für gramnegative Bakterien und von entscheidender Bedeutung für die Übertragung von DNA vom Spender zum Empfänger. Es wurde auch festgestellt, dass unsere Proben das repA-Gen enthielten, das das Initiationsreplikationsprotein, die ssDNA-abhängige ATPase und die DNA-Helikase kodierte, was höchstwahrscheinlich mit der Plasmidkopienummer63 korrelierte, einem internen Gen, das für die Transposition notwendig ist (tnpA). die Erkennung, Spaltung und Integration transponierbarer Elemente64 und einige Insertionssequenzen (IS): IS614 (beherbergt ARGs, z. B. das cfiA-Gen)65,66, IS1247 (kodiert den MDR-Phänotyp – aac(6')IIc/ereA2/ acc/arr/ereA2)67 und IS1111 (mit ARGs–blaGES-9)68.

Unsere Studie verglich die Häufigkeit von ARGs und MGEs in Schweinemist, sowohl unbehandelt als auch nach Lagerung oder Kompostierung. Die Entstehung und Verbreitung von ARGs hängt zweifellos mit der Anwesenheit von MGEs wie Plasmiden, Transposasen und Integrasen zusammen. Ein Koexistenznetzwerk, das auf der Grundlage der in unseren Proben gefundenen ARGs und MGEs erstellt wurde, bestätigte das gleichzeitige Vorkommen von MGEs, Integrons und ARGs sowohl bei der Kompostierung als auch bei der Lagerung. Obwohl das Koexistenznetzwerk für den mit der Lagerung behandelten Mist weniger Knoten aufweist als das während der Kompostierung erstellte Netzwerk, enthielt es positivere Korrelationen zwischen MGEs und ARGs, und diese neigten auch dazu, stärker zentralisiert zu sein: Der größte Cluster in der Lagerungsgruppe umfasst 10 MGEs , verglichen mit 7 MGEs bei der Kompostierung. Unsere Ergebnisse zeigen deutlich, dass Tiermist auch während der Kompostierung oder Lagerung als Hotspot für Antibiotikaresistenzen betrachtet werden sollte, in dem MGEs und ARGs gemeinsam vorhanden sind. Tiermist ist eine nährstoffreiche Umgebung, in der sich eine sehr dichte Bakterienpopulation befindet, die durch die Zugabe von Antibiotika und Schwermetallen günstige Bedingungen für den horizontalen Gentransfer schafft. Es wurde nachgewiesen, dass das Vorhandensein von Antibiotika im Mist die Aktivität von Transposasen erhöht, was zu einer häufigeren Exzision oder Integration von Genkassetten in Integrons führt69.

Die Tet-Gene, die im unbehandelten Schweinemist am häufigsten vorkommen, werden häufig als Plasmidkomponenten identifiziert. Ihre Verbreitung wird durch die Einfügung in Transposons wie Tn6298, Tn1721, Tn6303 oder IS1216 weiter erleichtert. Beispielsweise ist bekannt, dass die Gene tetW, tetQ und tetQ in der gastrointestinalen Mikrobiota des Wirts häufig vorkommen, was darauf hindeutet, dass die Gene innerhalb der Population eine hohe Stabilität aufweisen69,70. Bisher wurden drei Sulfonamid-Resistenzgene identifiziert: sul1, das häufig in Integrons der Klasse 1 vorkommt, sul2, das auf einem Plasmid mit breitem Wirtsbereich in E. coli gefunden wird, und sul3, das auch zusammen mit Integrons der Klasse 1 in einer Sorte gefunden wird von Umgebungen. Aufgrund ihrer Lage auf MGEs, zusammen mit Integrons und Transposons, haben Sulfonamid-Resistenzgene ein hohes Übertragungspotenzial und kommen in vielen Bakterienarten vor39.

Auch Schweinegülle weist relativ viele Beta-Lactam-Resistenzgene auf, da sie häufig große Mengen an Antibiotika dieser Gruppen erhalten. Die Gene befinden sich häufig in IncN-Plasmiden71. IncN-Plasmide tragen möglicherweise blaCTX-M, was darauf hindeutet, dass sie eine entscheidende Rolle bei der Verbreitung von ESBL-Stämmen in Gülle spielen. Darüber hinaus befinden sich die für den ESBL-Phänotyp kodierenden Gene häufig auf ISEcp1 oder ISCR172. Makrolid-Resistenzgene (z. B. ermB) und Tetracyclin-Resistenzgene können sich auch auf MGE befinden, beispielsweise die Tn916-Tn1545-Familie konjugativer Transposons. Andere interessante Gene wurden auch in mit MGEs assoziiertem Mist gefunden, z. B. wurde das Colistin-Resistenzgen auf verschiedenen Plasmidreplikontypen wie IncX4, IncI, IncFII, IncX1 und IncQ1 in E. coli gefunden39. In anderen Berichten wurde das Vorhandensein von ampC-, qnr- und Carbapenemase-Resistenzgenen festgestellt, die aus tierischem Mist auf Plasmiden mit einem breiten Wirtsspektrum stammen, wie z. B. Replikon-Typ-Plasmiden (IncP-1, IncQ, IncN, incW oder IncF), was deren hohen Anteil unterstreicht Transferpotenzial73.

Unsere Ergebnisse zeigen eine alarmierende Vielfalt und Häufigkeit von ARGs, was darauf hindeutet, dass roher Schweinegülle ein allgegenwärtiges Reservoir an ARGs und MGEs darstellt, was ein erhebliches Risiko für die Ausbreitung von ARGs in die Umwelt birgt, wenn sie freigesetzt werden. Das gleichzeitige Auftreten von AGRs und MGEs erhöht das Risiko der Übertragung von ARGs von Bakterien, die Nutztiere und deren Umgebung bewohnen, auf mit dem Menschen assoziierte bakterielle Krankheitserreger, was zu einer weiteren Ausbreitung unter menschlichen Populationen führt. Das Vorhandensein solcher resistenter Stämme schränkt die Auswahl möglicher Behandlungsstrategien bei Infektionen ein.

Im Allgemeinen wurden in allen getesteten Systemen positive Korrelationen zwischen der Zusammensetzung der Mikrobenpopulation und dem Vorhandensein spezifischer ARGs und MGEs und Gene, die den MDR-Mechanismus kodieren, sowie zwischen ARGs und MGEs beobachtet. Es wurde festgestellt, dass Kompostierung und Lagerung zu unterschiedlichen Veränderungen in der Menge der ARG-Gruppen führten, während andere niedrigere oder sogar höhere Genkopienzahlen aufwiesen; Es wurde jedoch festgestellt, dass MGEs eine der Gruppen sind, deren Häufigkeit während beider Prozesse zunimmt.

Das Koexistenznetzwerk, das sowohl MGEs als auch ARGs umfasst, impliziert, dass ein horizontaler Gentransfer nicht nur im Rohmist, sondern auch während der Kompostierung oder Lagerung vor der Feldausbringung stattfinden kann. Obwohl die relative Häufigkeit von MGEs im Allgemeinen während beider Behandlungen zunimmt und ihre Prävalenz mit einer hohen Vielfalt an Resistenzgenen verbunden ist, wird bei der Kompostierung insgesamt eine geringere Häufigkeit von MGEs beobachtet als bei der Lagerung; Dies deutet darauf hin, dass die Kompostierung zwar möglicherweise nicht ausreicht, um die Verbreitung von ARGs vollständig einzudämmen, sie jedoch effizienter ist als die einfache Lagerung.

Daraus lässt sich schließen, dass die Verwendung von kompostiertem Mist eine sicherere Strategie zur Gewährleistung der Bodenfruchtbarkeit und eines hohen Humusgehalts darstellt. Es stellt eine vielversprechende Alternative zu Mineraldüngern dar und trägt so zu einer ökologischeren Art des Pflanzenanbaus bei.

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Artikel und als ergänzende Materialien enthalten oder, falls nicht, auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Forschung wurde vom Nationalen Wissenschaftszentrum Polen (2017/25/Z/NZ7/03026) im Rahmen des Europäischen Horizonts 2020 im Rahmen des JPI-EC-AMR Joint Transnational Call (JPIAMR) finanziert, JPI-EC- AMR JTC 2017, Projekt INART – „Intervention des Transfers von Antibiotikaresistenzen in die Lebensmittelkette“ an MP und teilweise im Rahmen des Programms „Exzellenzinitiative – Forschungsuniversität (2020–2026)“ an der Universität Warschau.

Abteilung für Bakterienphysiologie, Fakultät für Biologie, Institut für Mikrobiologie, Universität Warschau, Warschau, Polen

Magdalena Zalewska, Aleksandra Błażejewska, Agnieszka Czapko und Magdalena Popowska

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MZ – Methodik, formale Analyse, Untersuchung, Datenkuration, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung; AB – Formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Originalentwurf; AC – Untersuchung; MP – Konzeptualisierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Supervision, Projektverwaltung, Finanzierungsakquise.

Korrespondenz mit Magdalena Popowska.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zalewska, M., Błażejewska, A., Czapko, A. et al. Behandlungsstrategien für Schweinegülle zur Eindämmung der Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen. Sci Rep 13, 11999 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39204-4

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Eingegangen: 19. Januar 2023

Angenommen: 21. Juli 2023

Veröffentlicht: 25. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39204-4

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